基因编码的光调控制造技术

本发明专利技术涉及笼蔽赖氨酸，其中所述笼蔽赖氨酸为式(I)或其盐。本发明专利技术还涉及包含笼蔽赖氨酸的多肽及其制备方法。本发明专利技术还涉及能够使tRNA负载笼蔽赖氨酸的tRNA合成酶。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及提供有用的笼蔽基团(caging group),及其在位点特异性引入蛋白质的方法中的用途及所述方法的用途。
技术介绍
生物活性化合物可通过使用光可去除的保护基团来保护，改变分子中的重要官能团以阻断其生物功效。已知保护所述基团的一种方式是笼蔽。通过例如对于系统的照射而去笼蔽，从而去除保护(笼蔽)基团并恢复分子的本征性质。可通过位点特异性引入笼蔽基团而实现蛋白质功能的精确光化学调控U。化学和酶方法，包括体外翻译3和化学连接4已经用于在体外光笼蔽蛋白质。这些方法已经被扩展为允许通过透化5或微注射6将笼蔽蛋白引入细胞，但是细胞递送仍旧存在挑战。最近，已经对于数种邻硝基苄基(ONB)笼蔽形式的氨基酸进行了基因编码，以使其响应琥珀终止密码子7’8。ONB基团在生理条件下是稳定的，但容易在250-365nm的紫外 (UV)光下被去除。应用ONB的不利之处在于，使用紫外光范围内250-365nm的较低部分可用于有效的光解，但该范围的紫外光对于细胞具有毒性，原因是其导致核酸光反应、破坏二硫键以及其他细胞损害，这可以在使用单个ONB基团笼蔽赖氨酸时发生8。赖氨酸残基是核定位序列的关键决定子9，是关键的翻译后修饰(包括泛素化、甲基化以及乙酰化)的靶，并且是许多重要酶活性位点中的关键残基。然而，将ONB笼蔽应用至赖氨酸残基还是不利的，原因是ONB笼蔽赖氨酸残基的光解产物导致不期望的赖氨酸的氨基缩合。因此，本领域中存在提供有效的赖氨酸笼蔽分子的问题。还存在提供允许将所述笼蔽分子位点特异性地掺入蛋白质中的方法和/或系统的问题。进一步的问题还在于提供产生所述蛋白同时减轻细胞递送笼蔽蛋白中存在的问题的方法。
技术实现思路
本专利技术涉及一种笼蔽赖氨酸分子，其中通过供电子取代基诱导笼蔽基团，以通过使用340nm以上的紫外光照射有效地去笼蔽。本专利技术还涉及在表I的达5个位置具有突变的正交吡咯赖氨酰-tRNA合成酶及由此所产生的正交吡咯赖氨酰-tRNA合成酶/tRNA对，其中所述突变存在于残基M241、A267、 Y27UL274 以及 C313。本专利技术的另一方面涉及将本专利技术的笼蔽赖氨酸掺入真核细胞的蛋白质中的体外方法，其中，所述方法包括如下步骤i)在编码所述蛋白质的核苷酸序列中的所需位点引入琥珀密码子，或取代编码所述蛋白质的核苷酸序列中的特定密码子；ii)将本文所述的表达系统引入细胞；iii)使用存在于培养基中的本文所述的笼蔽赖氨酸在所述培养基中培养所述细胞。本专利技术还一方面涉及本专利技术的笼蔽赖氨酸在通过340nm以上的紫外光照射测定或改变蛋白质的至少一种性质中的用途。本专利技术涉及一种笼蔽赖氨酸分子，其中通过供电子取代基诱导笼蔽基团，以通过使用340nm以上的紫外光照射而有效地去笼蔽。合适地，笼蔽基团在355nm以上的紫外光照射下、优选365nm的紫外光照射下有效去笼蔽。合适地，光解副产物不发生与赖氨酸氨基的缩合。合适地，笼蔽赖氨酸为式(I)权利要求1.一种笼蔽赖氨酸或其盐，其中所述笼蔽赖氨酸如式(I)所示。2.—种多肽,其包含权利要求I所述的笼蔽赖氨酸。3.根据权利要求2所述的多肽，其中所述笼蔽赖氨酸在所述多肽中的位置对应于野生型多肽中的赖氨酸残基的位置。4.根据权利要求2或权利要求3所述的多肽，所述多肽是三磷酸核苷酸结合蛋白。5.根据权利要求4所述的多肽，所述多肽是激酶。6.根据权利要求5所述的多肽，其中，所述笼蔽赖氨酸存在于所述激酶的催化位点。7.根据权利要求6所述的多肽，其中所述赖氨酸的去笼蔽使得所述多肽具有激酶活8.一种制备包含权利要求I所述的笼蔽赖氨酸的多肽的方法，所述方法包括翻译编码所述多肽的RNA，其中所述RNA包含正交密码子，其中所述翻译在识别所述正交密码子并且能够负载权利要求I所述的笼蔽赖氨酸的 tRNA的存在下，且在能够使所述tRNA负载权利要求I所述的笼蔽赖氨酸的tRNA合成酶的存在下以及在权利要求I所述的笼蔽赖氨酸的存在下进行。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述tRNA合成酶包括吡咯赖氨酰-tRNA合成酶， 其中相对于野生型序列，所述吡咯赖氨酰-tRNA合成酶在表I的1-5个位置具有突变，其中所述突变存在于对应于选自M241、A267、Y271、L274以及C313的1_5个残基的位置。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述tRNA合成酶包含4个突变，其中所述突变为 M241F、A267S、Y271C 以及 L274M。11.根据权利要求8至10任一项所述的方法，其中所述正交密码子为琥珀密码子 (TAG)。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述正交tRNA为PyltRNAeuA。13.—种制备包含权利要求I所述的笼蔽赖氨酸的多肽的方法，所述方法包括修饰编码所述多肽的核酸以在对应于所述多肽中期望掺入权利要求I所述的笼蔽赖氨酸的位置的一个或多个相应位置提供琥珀密码子。14.根据权利要求13所述的方法，其中，修饰所述核酸包括将赖氨酸密码子突变为琥珀密码子(TAG)。15.均一的重组的权利要求2所述的多肽，其中，所述多肽通过权利要求8至14任一项所述的方法制备。16.一种吡咯赖氨酰-tRNA合成酶，其相对于野生型序列在表I的1-5个位置具有突变，其中所述突变存在于对应于选自M241、A267、Y271、L274以及C313的1_5个残基的位17.根据权利要求16所述的正交吡咯赖氨酰-tRNA合成酶，其包含4个突变，其中，所述突变为 M241F、A267S、Y271C 以及 L274M。18.一种正交吡咯赖氨酰-tRNA合成酶/tRNA对，其中所述正交吡咯赖氨酰-tRNA合成酶是权利要求16或17所述的正交吡咯赖氨酰-tRNA合成酶，并且其中所述正交tRNA是 Py It RNAcua。全文摘要本专利技术涉及笼蔽赖氨酸，其中所述笼蔽赖氨酸为式(I)或其盐。本专利技术还涉及包含笼蔽赖氨酸的多肽及其制备方法。本专利技术还涉及能够使tRNA负载笼蔽赖氨酸的tRNA合成酶。文档编号C12N9/10GK102939375SQ201180022081 公开日2013年2月20日 申请日期2011年3月4日 优先权日2010年3月5日专利技术者贾森·钦, 维·P·阮, 阿诺·戈蒂埃, 亚历山大·戴特斯 申请人:医药研究委员会, 北卡罗来纳州大学本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾森·钦，维·P·阮，阿诺·戈蒂埃，亚历山大·戴特斯，
申请(专利权)人：医药研究委员会，北卡罗来纳州大学，
类型：
国别省市：