将非天然氨基酸掺入蛋白质中制造技术

本发明专利技术涉及将非天然氨基酸掺入到真核细胞的目的蛋白质中的方法，所述方法包括以下步骤：i)提供表达正交tRNA合成酶‑tRNA对的真核细胞、编码所述目的蛋白质的目的核酸序列和突变体eRF1，所述突变体eRF1具有与SEQ ID NO：4的人野生型eRF1序列具有至少60％序列同一性的氨基酸序列，所述目的核酸序列在用于掺入非天然氨基酸的位置上包含由tRNA识别的密码子；ii)在待掺入至由所述目的核酸序列编码的蛋白质中的非天然氨基酸存在的情况下培养所述真核细胞，其中所述非天然氨基酸是正交tRNA合成酶的底物；和iii)培养真核细胞以允许通过正交tRNA合成酶‑tRNA对将所述非天然氨基酸掺入目的蛋白质。本发明专利技术还涉及用途、宿主细胞、组合和试剂盒。

Incorporation of unnatural amino acids into proteins

The present invention relates to a non natural amino acid incorporation to target protein in eukaryotic cells, the method comprises the following steps: I) provides expression of target nucleic acid sequence and the mutant eRF1 tRNA synthase orthogonal tRNA eukaryotic cells, the encoding the target protein, the mutant eRF1 with wild type eRF1 the ID NO:4 sequence and SEQ has at least 60% sequence identity with the amino acid sequence of the target nucleic acid sequence for incorporation of non natural amino acid position contains identified by the tRNA codon; ii) culturing the eukaryotic cells to be incorporated into by the presence of non natural amino acids the target nucleic acid the sequence encoding a protein in the case, wherein the non natural amino acids is orthogonal tRNA synthetase substrate; and III) cultured eukaryotic cells to allow tRNA synthase by orthogonal tRNA on the Non natural amino acids incorporation into target proteins. The present invention also relates to uses, host cells, combinations, and kits.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】将非天然氨基酸掺入蛋白质中
本专利技术属于蛋白质表达的一般领域，特别是将非天然氨基酸掺入目的蛋白质中的领域。
技术介绍
遗传密码扩增允许将超过一百个非天然氨基酸位点特异性掺入蛋白质中。然而，这些方法的用途可能受限于非天然氨基酸掺入蛋白质中的效率。将非天然氨基酸有效、共翻译、位点特异性掺入蛋白质中将使得能够出现用于产生位点特异性修饰的重组蛋白(1，2)的方法，以及体内精确控制和成像蛋白质功能的策略(3，4)以及使用设计者非天然氨基酸来控制或报告蛋白质功能的许多其它方法。正交tRNA合成酶/tRNA对引导非天然氨基酸的掺入，最通常是响应于琥珀终止密码子(UAG)。非天然氨基酸掺入的效率通过以下二者来定义：i)正交合成酶/tRNA对能够响应于核糖体的A位点中的UAG密码子进行翻译延伸的内在效率，以及ii)释放因子与氨酰化正交tRNACUA竞争以终止蛋白质合成的效率。吡咯赖氨酰(Pyrolysyl)-tRNA合成酶(PylRS)/tRNACUA对可以说是针对遗传密码扩增所开发的最有用的一对，因为i)它在包括大肠杆菌(E.coli)、酵母、哺乳动物细胞、线虫(C.elegans)和黑腹果蝇(D.melanogaster)在内的一系列宿主中是正交的(orthogonal)，ii)PylRS不识别常见的20个氨基酸，iii)PylRS不识别同系物tRNACUA的反密码子，iv)PylRS的活性位点适应一系列荷载有用功能团的非天然氨基酸而不需要定向进化，v)PylRS的活性位点可以进化以识别荷载一系列在大肠杆菌中有用的功能团的结构多样的非天然氨基酸，和vi)在大肠杆菌中发现的合成酶变体可用于多种真核宿主，在此合成酶的定向进化的实施面临挑战(5)。目前非天然氨基酸的掺入在真核细胞中的效率比其在大肠杆菌中的效率更低。在实现遗传密码扩增方法的潜力的过程中，在真核细胞中向蛋白质中有效、位点特异性地掺入非天然氨基酸面临重大挑战。解决这一挑战将允许在真核细胞中合成修饰的重组蛋白质，并增加将新的化学功能引入蛋白质中以在真核细胞中以高的空间和时间精度控制和成像其功能的新兴策略。本专利技术寻求解决这个需求。专利技术概述本专利技术人已经开发了一种基于正交合成酶/tRNA对的表达系统，用于将一种或多种非天然氨基酸有效地掺入到在真核细胞(例如哺乳动物细胞或昆虫细胞)中表达的目的蛋白质中。有利地，本文所述的表达系统增加了在这些细胞中掺入非天然氨基酸的效率。此外，本专利技术人已经工程改造了eRF1(其通常在哺乳动物细胞中的所有三个终止密码子上终止翻译)以提供响应于TAG密码子的非天然氨基酸掺入的显著增加而不增加其他终止密码子的通读(read-through)。本文提供的数据首次证明，尽管天然eRF1识别所有三个终止密码子，仍然可以工程改造eRF1以选择性地提高真核细胞中响应于琥珀终止密码子的非天然氨基酸的掺入效率而不增加乳白或赭石终止密码子的通读。释放因子存在于原核系统中，如大肠杆菌(E.coli)表达系统。已经研究了温度敏感的释放因子(如tsRF1)用于原核表达系统中琥珀抑制的瞬时增加。细菌RF1与rRNA的相互作用已被精确定位于原核系统中rRNA的530环。例如，WO2008/065398在第4页第31至35行提到了这种相互作用。然而，没有从大肠杆菌系统到作为本专利技术主题的真核系统的跨越(crossover)。除了名称之外，原核和真核蛋白之间没有直接类推(analogy)。将突变体从非常不同的细菌蛋白转移到作为本专利技术主题的真核蛋白是不可能的。在原核系统中，不同的RF蛋白发挥不同的生物学功能，与之相比，真核系统有一种生物学上具有非常不同的“分裂功能”安排(arrangement)。相比之下，在真核系统中，单个eRF1蛋白提供多种终止功能。因此，哺乳动物eRF1蛋白质可能被认为在技术上与原核系统中的释放因子蛋白质非常不同。因此，通过选择性破坏RF1功能而在大肠杆菌中开发的用于增强响应于琥珀密码子的非天然氨基酸掺入的策略(12-16)不能扩展到真核系统。某些eRF1突变体是本领域已知的。已经在尝试研究eRF1功能的过程中纯粹描述了这些突变体。这些公开内容集中于eRF1生物学的学术研究。相比之下，本专利技术人首次教导使用某些eRF1突变体将非天然氨基酸掺入蛋白质中。实际上，已知没有报道工程改造真核翻译机制以提高使用正交tRNA合成酶/tRNA对在真核细胞中将非天然氨基酸位点特异性掺入蛋白质中的效率。本专利技术人首次在琥珀密码子表达系统的环境中实现eRF1突变体的利用。因此，本专利技术的优点是本专利技术人首次教导通过使用eRF1突变体增强了对琥珀密码子的抑制。因此，本专利技术的优点是本专利技术人首次教导使用eRF1突变体来增强抑制琥珀密码子。有利地，通过将改良的表达系统与工程改造的eRF1组合，携带单个非天然氨基酸的蛋白质的产量增加了17至20倍。含有非天然氨基酸的蛋白质的产率可以与不含终止密码子的基因产生蛋白质的产率相当。此外，改良的系统增加了蛋白质的产量，在多个位点(例如，3个或更多个位点)掺入非天然氨基酸从不可测量的低水平提高至无琥珀终止对照的43％。该方法可以有效地产生位点特异性修饰的治疗性蛋白质，并且能够使靶向细胞蛋白质用含有非天然氨基酸的形式定量替代，这使蛋白质功能的成像或合成调节成为可能。有利地，本公开内容可以使得能够在真核细胞中有效地产生位点特异性修饰的治疗性蛋白质，并能够使靶向细胞蛋白质用含有非天然氨基酸的形式定量替代，这使蛋白质功能成像或合成调节成为可能。因此，一方面，本专利技术提供了一种将非天然氨基酸掺入真核细胞的目的蛋白质中的方法，所述方法包括以下步骤：i)提供表达正交tRNA合成酶-tRNA对的真核细胞、编码所述目的蛋白质的目的核酸序列和突变体eRF1，所述突变体eRF1具有与SEQIDNO：4的人野生型eRF1序列具有至少67％序列同一性的氨基酸序列，所述目的核酸序列在用于掺入非天然氨基酸的位置上包含由tRNA识别的密码子；ii)在待掺入由所述目的核酸序列编码的蛋白质中的非天然氨基酸存在的情况下培养真核细胞，其中所述非天然氨基酸是正交tRNA合成酶的底物；和iii)培养真核细胞以允许通过正交tRNA合成酶-tRNA对将所述非天然氨基酸掺入目的蛋白质中。一方面，本专利技术涉及突变体eRF1用于将非天然氨基酸掺入真核生物细胞的目的蛋白质中的用途，所述突变体eRF1具有与SEQIDNO：4的人野生型eRF1序列具有至少60％、更适当地67％序列同一性的氨基酸序列。一方面，本专利技术涉及突变体eRF1多肽或编码其的核酸，所述突变体eRF1具有与SEQIDNO：4的人野生型eRF1序列具有至少60％、更适当地67％序列同一性的氨基酸序列，用于帮助通过翻译编码目的多肽的核酸将非天然氨基酸掺入所述目的多肽中，所述核酸包含引导将所述非天然氨基酸掺入所述目的多肽中的正交密码子。一方面，本专利技术涉及包含如上所述的突变体eRF1多肽或核酸的真核宿主细胞。一方面，本专利技术涉及真核宿主细胞，其包含(i)正交tRNA合成酶-tRNA对，和(ii)突变体eRF1，所述突变体eRF1具有与SEQIDNO：4的人野生型eRF1序列具有至少60％、更适当地67％序列同一性的氨基酸序列，以及任选地(ii本文档来自技高网...

【技术保护点】
将非天然氨基酸掺入真核细胞的目的蛋白质中的方法，所述方法包括以下步骤：i)提供表达正交tRNA合成酶‑tRNA对、编码所述目的蛋白质的目的核酸序列和突变体eRF1的真核细胞，所述突变体eRF1具有与SEQ ID NO：4的人野生型eRF1序列具有至少60％序列同一性的氨基酸序列，所述目的核酸序列在用于掺入非天然氨基酸的位置上包含由tRNA识别的密码子；ii)在存在待掺入由所述目的核酸序列编码的蛋白质中的非天然氨基酸的情况下培养所述真核细胞，其中所述非天然氨基酸是正交tRNA合成酶的底物；和iii)培养所述真核细胞以允许通过所述正交tRNA合成酶‑tRNA对将所述非天然氨基酸掺入所述目的蛋白质中。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.10.27 GB 1419109.21.将非天然氨基酸掺入真核细胞的目的蛋白质中的方法，所述方法包括以下步骤：i)提供表达正交tRNA合成酶-tRNA对、编码所述目的蛋白质的目的核酸序列和突变体eRF1的真核细胞，所述突变体eRF1具有与SEQIDNO：4的人野生型eRF1序列具有至少60％序列同一性的氨基酸序列，所述目的核酸序列在用于掺入非天然氨基酸的位置上包含由tRNA识别的密码子；ii)在存在待掺入由所述目的核酸序列编码的蛋白质中的非天然氨基酸的情况下培养所述真核细胞，其中所述非天然氨基酸是正交tRNA合成酶的底物；和iii)培养所述真核细胞以允许通过所述正交tRNA合成酶-tRNA对将所述非天然氨基酸掺入所述目的蛋白质中。2.突变体eRF1用于将非天然氨基酸掺入真核生物细胞的目的蛋白质中的用途，所述突变体eRF1具有与SEQIDNO：4的人野生型eRF1序列具有至少60％序列同一性的氨基酸序列。3.突变体eRF1多肽或编码其的核酸，用于通过翻译编码目的多肽的核酸帮助将非天然氨基酸掺入所述目的多肽中，所述突变体eRF1具有与SEQIDNO：4的人野生型eRF1序列具有至少60％序列同一性的氨基酸序列，所述核酸包含指导将所述非天然氨基酸掺入所述目的多肽中的正交密码子。4.包含权利要求3的突变体eRF1多肽或核酸的真核宿主细胞。5.真核宿主细胞，其包含(i)正交tRNA合成酶-tRNA对，和(ii)突变体eRF1，所述突变体eRF1具有与SEQIDNO：4的人野生型eRF1序列具有至少60％序列同一性的氨基酸序列，以及任选地(iii)编码目的蛋白质的目的核酸序列，所述目的核酸序列在用于掺入非天然氨基酸的位置上包含由tRNA识别的密码子。6.包含核酸的组合或试剂盒，所述核酸编码：(i)正交tRNA合成酶-tRNA对，和(ii)突变体eRF1，所述突变体eRF1具有与SEQIDNO：4的人野生型eRF1序列具有至少60％序列同一性的氨基酸序列，以及任选地(iii)编码目的蛋白质的目的核酸序列，所述目的核酸序列在用于掺入非天然氨基酸的位置上包含由tRNA识别的密码子。7.根据权利要求5的真核宿主细胞或根据权利要求6的组合或试剂盒，还包含非天然氨基酸，例如BocK或CypK或BCNK。8.根据权利要求1的方法、根据权利要求2的用途、根据权利要求3的突变体eRF1多肽、根据权利要求4、5或7中任一项的真核宿主细胞或根据权利要求6的组合或试剂盒，其中所述突变体eRF1相对于野生型eRF1对照提供增加的非天然氨基酸掺入效率。9.根据权利要求1的方法、根据权利要求2的用途、根据权利要求3的突变体eRF1多肽、根据权利要求4、5或7中任一项的真核宿主细胞或根据权利要求6的组合或试剂盒，其中所述突变体eRF1相对于SEQIDNO：4包含选自以下的突变或...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·W·钦，W·H·施米德，S·J·埃尔萨瑟，E·Y·许姆，
申请(专利权)人：医药研究委员会，
类型：发明
国别省市：英国,GB