用于生物合成对甲苯甲酸和对苯二甲酸的微生物和方法技术

本发明专利技术提供具有(2-羟基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途径、对甲苯甲酸途径和/或对苯二甲酸途径的非天然存在的微生物。本发明专利技术另外还提供使用这类生物体来产生(2-羟基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途径、对甲苯甲酸途径或对苯二甲酸途径的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
本专利技术总的来讲涉及生物合成过程，更具体地讲，本专利技术涉及具有对甲苯甲酸(p-toluate)对苯二甲酸(terephthalate)或(2_轻基_3_甲基_4_氧代丁氧基)膦酸酯生物合成能力的生物体。对苯二甲酸(也称为对苯二甲酸(terephthalic acid)和PTA)是聚对苯二甲酸乙二酯(polyethylene terepthalate, PET)的直接(immediate)前体,用于制造衣物、树脂、塑料瓶，甚至用作禽饲料添加剂。几乎所有的PTA都是在称为中世纪工艺(the Mid CenturyProcess)的工艺中在空气中氧化而由对二甲苯生产。这个氧化作用在高温下、在乙酸溶剂中用由钴和/或锰盐组成的催化剂来进行。对二甲苯来源于石油化学来源并由石脑油的高苛刻度催化重整而形成。二甲苯也从石脑油蒸汽裂化器中的热解汽油气流和通过甲苯歧化获得。 用于生产可再生PTA的成本-有效方法迄今尚未开发出来。PTA、甲苯和其它的芳族前体能被有些细菌自然地降解。然而，这些降解途径通常包括以可降解方向不可逆操作的单加氧酶。因此，PTA的生物合成途径受到迄今已知酶特性的严格限制。一种颇有前景的PTA前体是对甲苯甲酸，也称为对甲基苯甲酸酯。对甲苯甲酸是在某些工业过程中将对二甲苯氧化成PTA的中间体。它也是聚合物稳定剂、杀虫剂、光敏化合物、动物饲料补充剂和其它有机化学品的中间体。仅在水溶液中微溶，对甲苯甲酸在生理温度下为固体，其熔点为275°C。用于从糖贮存物(feedstocks)合成该化合物的微生物催化剂迄今为止还没有描述过。因此，存在有效生产商用量化合物例如对甲苯甲酸或对苯二甲酸的替代方法的需求。本专利技术满足了这种需求，也提供了有关优势。专利技术概述本专利技术提供具有(2-羟基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途径、对甲苯甲酸途径和/或对苯二甲酸途径的非天然存在的微生物。本专利技术另外还提供使用这类生物体来产生(2-羟基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途径、对甲苯甲酸途径或对苯二甲酸途径的方法。附图简述图I显示由3-磷酸甘油醛和丙酮酸生成(2-羟基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯(2H3M40P)的示例性途径的示意图。G3P为3-磷酸甘油醛，DXP为1_脱氧-D-木酮糖-5-磷酸，和2ME4P为C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸。酶是(A) DXP合酶；(B) DXP还原异构酶(reductoisomerase);和(C)2ME4P 脱水酶。图2显示对甲苯甲酸的示例性替代莽草酸途径的示意图。酶是(A) 2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸合酶；(B) 3-脱氢奎尼酸合酶；(C) 3-脱氢奎尼酸脱水酶；(D)莽草酸脱氢酶；(E)莽草酸激酶；(F)3-磷酸莽草酸-2-羧基乙烯基转移酶；(G)分支酸合酶；和(H)分支酸裂合酶。化合物是(I) (2-羟基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯；(2) 2，4- 二羟基-5-甲基-6-[(膦酰氧基)甲基]噁烷-2-羧酸酯；(3) 1，3- 二羟基-4-甲基-5-氧代环己烷-I-羧酸酯；⑷5-羟基-4-甲基-3-氧代环己-I-烯-I-羧酸酯；(5) 3，5- 二羟基-4-甲基环己-I-烯-I-羧酸酯；(6) 5-羟基-4-甲基-3-(膦酰氧基)环己-I-烯-I-羧酸酯；⑵5- [ (I-羧基乙-I-烯-I-基)氧基]-4-甲基-3-(膦酰氧基)环己-I-烯-I-羧酸酯；⑶3-[ (I-羧基乙-I-烯-I-基)氧基]-4-甲基环己-1，5- 二烯-I-羧酸酯；和(9)对甲苯甲酸。图3显示将对甲苯甲酸(p-toluate)转变成对苯二甲酸(PTA)的示例性途径。反应A、B和C分别由对甲苯甲酸甲基-单加氧酶还原酶、4-羧基苯甲醇脱氢酶和4-羧基苯甲醛脱氢酶催化。所示化合物是(I)对甲苯甲酸(p-toluic acid) ; (2)4-羧基苯甲醇；(3)4-羧基苯甲醛；和⑷对苯二甲酸。专利技术详述本专利技术涉及具有对甲苯甲酸、对苯二甲酸或(2-羟基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯的生物合成生产能力的细胞和生物体的设计和生产。本文所述结果表明代谢途径可以进行设计和重组工程以实现对甲苯甲酸、对苯二甲酸或(2-羟基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯在大肠杆菌(Escherichia coli)及其它细胞或生物体中的生物合成。对甲苯甲酸、对苯二甲酸或(2-羟基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯的生物合成性生产可以通过构建具有设计的代谢基因型的菌株来证实。这些代谢工程改造的细胞或生物体也可以经受适应性进化以进一步增强对甲苯甲酸、对苯二甲酸或(2-羟基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯的生物合成，包括在接近理论最大生长的条件下。大肠杆菌中的莽草酸生物合成途径将赤藓糖-4-磷酸转变成分支酸，一种重要中间体，导致生物合成许多必需代谢物，包括4-羟基苯甲酸酯。4-羟基苯甲酸酯在结构上类似于对甲苯甲酸，即对苯二甲酸的一种工业前体。正如本文所公开的，莽草酸途径酶可用于接受替代底物(2-羟基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯(2H3M40P)并将其转化成对甲苯 甲酸。另外，利用来自类异戊二烯(isoprenoid)生物合成的非甲羟戊酸途径的酶，该途径用于合成2H3M40P前体。本文公开的是对微生物进行工程改造以从碳水化合物贮存物生产可再生对甲苯甲酸或对苯二甲酸(PTA)的策略。首先，在三个酶促步骤中，将3-磷酸甘油醛(G3P)和丙酮酸转变成2-羟基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯(2H3M40P)(参见实施例I和图I)。随后，2H3M40P中间体通过莽草酸途径中的酶转化成对甲苯甲酸(参见实施例II和图2)。对甲苯甲酸可以通过微生物进一步转变成PTA(参见实施例III和图3)。G3P转变成对甲苯甲酸需要一个ATP、两个还原当量的(NAD(P)H)和两分子磷酸烯醇丙酮酸，按照以下的净反应式。G3P+2PEP+ATP+2NAD (P) H+2H+ —对甲苯甲酸 +4Pi+ADP+2NAD (P)++C02+H20从葡萄糖合成G3P需要额外的ATP。最大理论对甲苯甲酸产量为0. 67mol/mol (0. 51g/g)(从葡萄糖中减去碳需要能量)。在假定每合成I分子对甲苯甲酸要消耗掉2个ATP的情况下,从葡萄糖到对甲苯甲酸的产量预计为0. 62mol/mol (0. 46g/g)对甲苯甲酸。如果对甲苯甲酸被实施例III中描述的酶进一步转变成PTA，那么从葡萄糖到PTA的产量预计为0. 64mol/mol (0. 58g/g)。在这种情形下,对甲苯甲酸氧化成PTA产生额外的净还原当量，按照以下的净反应式对甲苯甲酸 +02+NAD+ — PTA+NADH+2H+以下各小节描述了用于催化建议途径各步骤的候选酶。本文所用的术语“非天然存在的”当用于涉及本专利技术的微生物时，意指该微生物具有至少一个遗传改变，该遗传改变在正常情况下在参考菌种的天然存在的菌株(包括参考菌种的野生型菌株)中不存在。遗传改变包括例如微生物遗传材料的修饰，该修饰引入编码代谢多肽的可表达核酸、其它核酸添加、核酸缺失和/或其它功能破坏。这样的修饰包括例如参考菌种的异源多肽、同源多肽或者异源多肽和同源多肽二者的编码区及其功能片段。另外的修饰包括例如非编码调节区，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.01.29 US 61/299,7941.非天然存在的微生物，包括一种具有(2-羟基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途径的微生物，该微生物包含至少一种编码以足以产生(2-羟基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯的量表达的(2-羟基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途径酶的外源核酸，所述(2-羟基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途径包含2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸脱水酶。2.权利要求I的非天然存在的微生物，其中所述(2-羟基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途径还包含I-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶或I-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶。3.权利要求I的非天然存在的微生物，其中所述(2-羟基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途径还包含I-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶和I-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶。4.权利要求I的非天然存在的微生物，其中所述微生物包含三种外源核酸，各自编码(2-羟基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途径酶。5.权利要求4的非天然存在的微生物，其中所述三种外源核酸编码2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸脱水酶、I-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶和I-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶。6.权利要求I的非天然存在的微生物，其中所述至少一种外源核酸是异源核酸。7.权利要求I的非天然存在的微生物，其中所述非天然存在的微生物是在基本上厌氧的培养基中。8.用于生产(2-羟基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯的方法，包括将权利要求I的非天然存在的微生物在足以产生(2-羟基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯的条件下培养足够的时间周期。9.权利要求8的方法，其中所述非天然存在的微生物是在基本上厌氧的培养基中。10.权利要求8的方法，其中所述微生物包含三种外源核酸，各自编码(2-羟基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途径酶。11.权利要求10的方法，其中所述三种外源核酸编码2-c-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸脱水酶、I-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶和I-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶。12.权利要求8的方法，其中所述至少一种外源核酸是异源核酸。13.非天然存在的微生物，包括一种具有对甲苯甲酸途径的微生物，该微生物包含至少一种编码以足以产生对甲苯甲酸的量表达的对甲苯甲酸途径酶的外源核酸，所述对甲苯甲酸途径包含2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸合酶、3-脱氢奎尼酸合酶、3-脱氢奎尼酸脱水酶、莽草酸脱氢酶、莽草酸激酶、3-磷酸莽草酸-2-羧基乙烯基转移酶、分支酸合酶或分支酸裂合酶。14.权利要求13的非天然存在的微生物，其中所述微生物包含两种外源核酸，各自编码对甲苯甲酸途径酶。15.权利要求13的非天然存在的微生物，其中所述微生物包含三种外源核酸，各自编码对甲苯甲酸途径酶。16.权利要求13的非天然存在的微生物，其中所述微生物包含四种外源核酸，各自编码对甲苯甲酸途径酶。17.权利要求13的非天然存在的微生物，其中所述微生物包含五种外源核酸，各自编码对甲苯甲酸途径酶。18.权利要求13的非天然存在的微生物，其中所述微生物包含六种外源核酸，各自编码对甲苯甲酸途径酶。19.权利要求13的非天然存在的微生物，其中所述微生物包含七种外源核酸，各自编码对甲苯甲酸途径酶。20.权利要求13的非天然存在的微生物，其中所述微生物包含七种外源核酸，各自编码对甲苯甲酸途径酶。21.权利要求19的非天然存在的微生物，其中所述八种外源核酸编码2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸合酶、3-脱氢奎尼酸合酶、3-脱氢奎尼酸脱水酶、莽草酸脱氢酶、莽草酸激酶、3-磷酸莽草酸-2-羧基乙烯基转移酶、分支酸合酶和分支酸裂合酶。22.权利要求13的非天然存在的微生物，其中所述微生物还包含(2-羟基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途径。23.权利要求22的非天然存在的微生物，其中所述(2-羟基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途径包含2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸脱水酶、I-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶或I-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶。24.权利要求23的非天然存在的微生物，其中所述(2-羟基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途径包含2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸脱水酶、I-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶和I-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶。25.权利要求13的非天然存在的微生物，其中至少一种外源核酸是异源核酸。26.权利要求13的非天然存在的微生物，其中所述非天然存在的微生物是在基本上厌氧的培养基中。27.用于生产对甲苯甲酸的方法，包括将权利要求13的非天然存在的微生物在足以产生对甲苯甲酸的条件下...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗宾·E·奥斯特豪特，
申请(专利权)人：基因组股份公司，
类型：
国别省市：