本发明专利技术提供了一种转基因玉米GA21品系的LAMP检测引物及方法。所述LAMP检测引物如SEQ?ID?NO：1-6，利用所述的LAMP检测引物，以BstDNA聚合酶大片段启动环介导等温扩增，通过观察浊度，或加入显色液观察颜色变化来判定检测结果。本发明专利技术提供的一种普遍适用于基层实验室的快速、简便、准确、特异检测转基因玉米GA21品系的LAMP检测引物及方法，快速、高效、简便，扩增特异性高，保证了结果的准确性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术提供了一种转基因玉米GA21品系的LAMP检测引物及方法。
技术介绍
随着全球转基因产品的日益增多，以及越来越多的转基因作物特异品系获得商品化生产，检测特异性品系已成为国际上转基因成分检测的发展趋势。目前，检测转基因特异品系的方法主要有普通PCR方法和实时荧光PCR方法。普通PCR方法，具有耗时长，操作繁琐，灵敏度不够，容易产交叉污染，质控复杂，假阳性、假阴性比例偏高等缺点。实时荧光PCR方法则具有成本昂贵、技术要求高、需要大型的仪器设备等缺点，均已经不能满足食品中转基因成分的日常监管和食品生产行业内部质控的需求。因此，目前急需建立能够普遍适用于检验检疫一线的基层实验室的快速、简便、准确的转基因品系检测方法。环介导等温扩增技术 ( loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是2000 年开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6 个区域设计4~6 条特异引物，利用一种链置换DNA 聚合酶在等温条件(63 ℃左右) 保温30－60分钟，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物（焦磷酸镁），形成乳白色沉淀，通过观察浊度，或加入显色液观察颜色变化来判定结果。LAMP技术具有简便、高效、特异、快速等优点，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程，在灵敏度、特异性能媲美甚至优于普通PCR技术，不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR。LAMP技术在食源性致病微生物的快速检测中已得到广泛应用，但在转基因产品检测上的应用研究很少。目前，国内采用LAMP技术对转基因成分的研究尚处于起步阶段，且主要应用于启动子、外源基因的检测，极少应用于转基因特异品系的检测。目前未见转基因玉米GA21品系的LAMP检测方法的研究报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种普遍适用于基层实验室的快速、简便、准确、特异检测转基因玉米GA21品系的LAMP检测引物及方法。本专利技术首先提供了一种转基因玉米GA21品系的LAMP检测引物，所述LAMP检测引物如下：外引物F3：5'-GCT GTA GTT GTT GGC TGT-3'外引物B3：5'-CCT TTT AAC TGA TGT TTT CAC TT-3' 内引物FIP：5'-TGG GGG ATC CAC TAG TTC TAG AGG TGG AAA GTT CCC AGT TGA-3'内引物BIP：5'-GCA GGT CGA GGT CAT TCA TAT GGA CCA GGT AAT CTT ACC TTT G-3'环引物LF：5'-CTG CAC TTC CTC TTT AGC ATC C-3'环引物LB：5'-CTT GAG AAG AGA GTC GGG ATA GTC-3'。本专利技术还提供了一种转基因玉米GA21品系的LAMP检测方法，利用所述的LAMP检测引物，以Bst DNA聚合酶大片段启动环介导等温扩增，通过观察浊度，或加入显色液观察颜色变化来判定检测结果。环介导等温扩增的反应条件为：63℃温育1h，80℃保温5min；反应体系为：10 ×ThermoPol缓冲液2.5μL，10 μmol/L外引物F3 0.5μL，10 μmol/L外引物B3 0.5μL，40 μmol/L环引物LF 0.5μL，40 μmol/L环引物LB 0.5μL，40 μmol/L内引物FIP 1.0μL，40 μmol/L内引物BIP 1.0μL，10 mmol/L dNTPs 3.5μL，5 mol/L甜菜碱 4.0μL，150 mmol/L硫酸镁1.0μL，8 U/μL Bst DNA聚合酶大片段1.0μL，100 ng/μL DNA模板2.0μL，ddH2O 7μL。本专利技术建立的LAMP检测方法的优点：①快速、高效：扩增约1 h即可完成，且产率高；②简便：在核酸大量合成时，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物-焦磷酸镁沉淀，通过观察浊度或加入显色液观察颜色变化就可判定检测结果，不需要特殊的、昂贵的仪器设备，操作非常简便；③高特异性：采用六个区段、四条或六条引物，扩增特异性高，保证了结果的准确性。 国内外还未见转基因玉米GA21品系的LAMP检测引物及方法的报道，本专利技术首次设计、筛选到了转基因GA21品系的LAMP检测引物，并建立了LAMP检测方法。附图说明图1为GA21品系外源基因的序列，加框部分是mepsps基因，阴影部分是linker基因，加下划线部分是r-act基因。图2为GA21品系在植物基因与外源基因组合连接处的序列。图3为3套引物反应温度的测试结果，A.set1引物；B. set2引物；C. set3引物；1~6. 反应温度分别为：60.0℃、61.2℃、61.9℃、63.3℃、64.1℃、64.8℃。图4为3套引物在反应温度为63℃的特异性测定结果，A. set1引物；B. set2引物；C. set3引物；1. ddH2O；2. 非转基因玉米；3. 非转基因小麦；4. 非转基因大豆；5. 5% GA21标准品。图5为LAMP方法的特异性试验结果，A1~7分别为：ddH2O、非转基因大米、非转基因小麦、非转基因玉米、非转基因大豆、非转基因番茄、非转基因马铃薯； B1~6分别为：转基因玉米Mon89034品系、转基因玉米Tc1507品系、转基因玉米Mir604品系、转基因玉米Mon810品系、转基因玉米Bt11品系、5%GA21标准品。图6为LAMP法灵敏度测定实时监控结果，1. 0.1% GA21；2. 1% GA21；3. 5% GA21；4. 0.5% GA21；5. 0.05% GA21；6. 0.01% GA21；7. 非转基因玉米。图7为LAMP法灵敏度测定结果，1. 非转基因玉米；2. 0.01% GA21；3. 0.05% GA21；4. 0.1% GA21；5. 0.5% GA21；6. 1% GA21；7. 5% GA21。图8为送检样品中GA21品系的LAMP检测结果，A1~10分别为：ddH2O、非转基因玉米、真空玉米棒、冷冻甜玉米、奶香味韩味玉米（进口）、辣味韩味玉米、玉米淀粉、黄大豆、油豆腐、脱脂大豆；B1~10分别为：香干、正康鸡蛋豆奶、正康草莓豆奶、大米、白粿干、米粉干、小麦、面粉、饼干、马铃薯淀粉；C1~10分别为：薯片、番茄酱、进口转基因玉米酒糟粕、进口转基因玉米1、进口转基因玉米2、进口转基因玉米3、进口转基因玉米4、进口转基因玉米5、0.1% GA21、5% GA21。具体实施方式1 试验材料5%、1%、0.1%GA21标准品购自北京世纪奥科生物技术有限公司。非转基因玉米、真空玉米棒、冷冻甜玉米、奶香味韩味玉米（进口）、辣味韩味玉米、玉米淀粉、黄大豆、油豆腐、脱脂大豆、香干、正康鸡蛋豆奶、正本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种转基因玉米GA21品系的LAMP检测引物，其特征在于：所述LAMP检测引物如下：外引物F3：5“？GCT？GTA？GTT？GTT？GGC？TGT？3“外引物B3：5“？CCT？TTT？AAC？TGA？TGT？TTT？CAC？TT？3“？内引物FIP：5“？TGG？GGG？ATC？CAC？TAG？TTC？TAG？AGG？TGG？AAA？GTT？CCC？AGT？TGA？3“内引物BIP：5“？GCA？GGT？CGA？GGT？CAT？TCA？TAT？GGA？CCA？GGT？AAT？CTT？ACC？TTT？G？3“环引物LF：5“？CTG？CAC？TTC？CTC？TTT？AGC？ATC？C？3“环引物LB：5“？CTT？GAG？AAG？AGA？GTC？GGG？ATA？GTC？3“。
【技术特征摘要】
1.一种转基因玉米GA21品系的LAMP检测引物，其特征在于：所述LAMP检测引物如下：
外引物F3：5'-GCT GTA GTT GTT GGC TGT-3'
外引物B3：5'-CCT TTT AAC TGA TGT TTT CAC TT-3'
内引物FIP：5'-TGG GGG ATC CAC TAG TTC TAG AGG TGG AAA GTT CCC AGT TGA-3'
内引物BIP：5'-GCA GGT CGA GGT CAT TCA TAT GGA CCA GGT AAT CTT ACC TTT G-3'
环引物LF：5'-CTG CAC TTC CTC TTT AGC ATC C-3'
环引物LB：5'-CTT GAG AAG AGA GTC GGG ATA GTC-3'。
2.一种转基因玉米GA21品系的LAMP检测方法，其特征在于：利用权利要求1所述的LAM...
【专利技术属性】
技术研发人员：邵碧英，陈文炳，曾莹，缪婷玉，彭娟，
申请(专利权)人：福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：
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