一种ERβ基因缺陷对eNOS-NO通路表达影响的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种ERβ基因缺陷对eNOS-NO通路表达影响的检测方法，包括检测eNOS、Cam和小窝蛋白-1相关mRNA表达量，和检测eNOS、Cam和小窝蛋白-1三种蛋白量。本发明专利技术通过检测eNOS-NO通路中参与蛋白的表达及含量变化，进而提供一种ERβ基因缺陷对eNOS-NO通路表达影响的检测方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及组织化学检测的方法，特别地，本专利技术涉及一种ERβ基因缺陷对eNOS-NO通路表达影响的检测方法。 
技术介绍
血管内皮在阴茎的勃起过程中扮演了十分重要的角色, 血管内皮功能障碍是阴茎勃起功能障碍(ED)的病理基础之一, 并且，ED的发生往往早于其他伴有明显内皮损伤的心血管疾病如冠心病等，被认为是此类疾病的早期警报器。血管内皮细胞是循环血液与血管平滑肌细胞间的机械屏障，容易受到体内外多种因素如高血压、高血脂、高血糖、氧化应激、高同型半胱氨酸血症、吸烟等的损伤，受损后的血管内皮细胞功能尤其是内分泌功能失调，使其分泌的多种活性物质或是与这些活性物质有关的其他物质之间的平衡被打破，从而导致内皮损伤/功能障碍。 保护阴茎血管内皮是勃起功能障碍治疗的新途径。现有研究证实, 雌激素通过直接效应(改善内皮功能、抑制血管平滑肌增殖、迁移)和间接效应(调节脂代谢、改善凝血纤溶系统功能和抗氧化作用) 改善血管功能，减弱有害刺激的细胞反应，是重要的心血管保护因素，雌激素是通过其受体对心血管内皮具有保护效应, 缺乏雌激素或其受体, 血管内皮易受损伤。雌激素受体(estrogenreceptor, ER)包括α和β2个亚型, 在血管内均有表达, 近年研究发现，阴茎海绵体内也存在ER，在包括啮齿类动物、兔等多个物种的阴茎中发现有ERα和ERβ的表达，且以ERβ为主。雌激素通过ER介导的血管保护作用涉及到与血管张力调控、内皮细胞凋亡、氧化应激、炎症反应、内皮祖细胞的增值与粘附等有关的多种分子，其中对内皮源性一氧化氮合酶 - 一氧化氮(eNOS-NO)途径相关分子的调控至关重要，此信号途径主要参与的蛋白有eNOS、小窝蛋白-1(caveolin-1)和钙调蛋白(Cam)，如何检测此信号途径中蛋白表达及含量的变化成为研究ERβ基因缺陷对eNOS-NO通路表达影响的重要问题。 
技术实现思路
本专利技术目的在于：通过检测eNOS-NO通路中参与蛋白的表达及含量变化，进而提供一种ERβ基因缺陷对eNOS-NO通路表达影响的检测方法。 本专利技术采取的技术方案为：一种ERβ基因缺陷对eNOS-NO通路表达影响的检测方法，包括检测eNOS、Cam和小窝蛋白-1相关mRNA表达量，和检测eNOS、Cam和小窝蛋白-1三种蛋白量。 所述eNOS、Cam和小窝蛋白-1相关mRNA表达量的检测，包括如下步骤： 1) 组织总RNA的提取：A. 选择刚刚死亡的ERβ缺陷型动物和正常动物，取部分阴茎中段组织冻存于液氮中，检测时从液氮中取冻存的阴茎组织，加入0.5 ml TRIzol试剂和液氮，充分研磨，直至阴茎组织成粉末状，最后补加0.5 ml TRIzol试剂，室温下静置5 min，保证样品体积不应超过TRIzol体积的10％，然后于4 ℃，12000×g离心15 min；B. 取上清液置另一EP管中，每管加入0.2 ml氯仿，剧烈震荡15 s混匀；C. 将匀浆的样品在室温下放置2～3 min，使核酸蛋白复合物完全分离，然后于 4 ℃，12000 ×g离心15 min；D. 经离心后的样品分为三层，底层为黄色的有机相，上层为无色的水相和一个中间层，RNA主要存在于水相中，将水相转移到新的EP管中，加入等体积的异丙醇沉淀水相中的RNA，混匀并于室温放置10 min；E. 于4 ℃，12000 ×g离心10 min，离心管底部会出现胶状RNA沉淀；F. 移去上清，每管加入1 ml 75% 的乙醇洗涤RNA沉淀，混匀，于4 ℃，7600×g离心5 min；G. 移去上清，沉淀在室温下干燥10 min，用适量的DEPC水溶解RNA沉淀, 用分光光度计测其浓度及纯度，取适量总RNA稀释后测定A260和A280的比值，计算RNA的浓度；H. 取8 μl RNA样品用1.0%琼脂糖进行电泳，观察RNA的完整性；2）反转录使用Fermentas第一链cDNA合成试剂盒进行反转录反应，反应体系如下： 5×Reactionbuffer4.0μl10mmol/LdNTP2.0μlOlig(dT)18引物1.0μlRNA酶抑制剂1.0μlM-MuLV反转录酶(200U/μl)1.0μlRNA模板1μg无核酶水补至20μl反应条件为：42 ℃反应60 min，70 ℃ 5 min 灭活，产物于-20 ℃保存待用；3）聚合酶链式反应在Genbank上查找小鼠Cam、caveolin-1、eNOS及β-actin的mRNA序列，取其保守区，使用primer 5.0软件对引物进行设计，引物序列为：  反应体系如下：2×Taq酶PCR反应混合液12.5μl引物1(20μmol/L)1.5μl引物2(20μmol/L)1.5μlcDNA模板2.0μlddH2O7.5μl反应条件为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，退火30 s，72 ℃延伸时间30 s，30～35 个循环，72 ℃延伸10 min；4）电泳及观察分析PCR产物采用10 V/cm的电压，在1%琼脂糖凝胶上电泳，电泳完成后, 采用凝胶电泳成像分析系统观察、拍照，用Quantity-One软件分析目的基因和内参基因，即β-actin的灰度，以目的基因/β-actin的比值表示目的基因的相对表达量。所述eNOS、Cam和小窝蛋白-1三种蛋白量的检测，包括如下步骤： 1）选择刚刚死亡的ERβ缺陷型动物和正常动物，取部分阴茎中段组织，裂解液裂解阴茎组织, 提取总蛋白,蛋白核酸测定仪测各组蛋白浓度后进行蛋白定量, 定量后的总蛋白加入6倍的上样缓冲液混匀后沸水浴煮沸5 min；2）制备SDS-PAGE, 每泳道加总蛋白30 mg, 在电泳缓冲液存在的情况下进行70V恒压电泳，待样品进入分离胶后，将电压调至90V, 当溴酚蓝染料距硅胶框1 cm时，停止电泳，关闭电源；接着，在转移缓冲液存在的情况下经湿转转移到PVDF膜上， eNOS、Cam、小窝蛋白-1的转膜条件分别为：350mA、150min；350mA、45min；350mA、65min ；50 g/L脱脂奶粉37℃下封闭1 h，1∶200稀释的一抗，即兔抗小鼠β-actin多克隆抗体、兔抗小鼠Cam多克隆抗体、兔抗小鼠小窝蛋白-1多克隆抗体、兔抗小鼠eNOS多克隆抗体，分别 4℃孵育过夜，次日封闭液洗膜5 min, 共3次, 再以TBST洗膜5 min, 共3次，加1∶800稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗37℃下封闭1h，封闭液洗膜5 min,共3次,再以TBST洗膜5 min, 共3次；3）DAB显色约1 min, 蒸馏水终止显色反应, 实验结果拍照，用Quantity-One软件分析每个条带的灰度值, 以目的条带与β-actin条带灰度值比值表示目的蛋白的相对表达量。所述电泳缓冲液配制方法为：称取3.0g Tris，甘氨酸14.4g，溶于900ml纯水中，充分混匀，溶解后加入10%SDS 10ml，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ERβ基因缺陷对eNOS？NO通路表达影响的检测方法，包括检测eNOS、Cam和小窝蛋白？1相关mRNA表达量，和检测eNOS、Cam和小窝蛋白？1三种蛋白量。

【技术特征摘要】
1.一种ERβ基因缺陷对eNOS-NO通路表达影响的检测方法，包括检测eNOS、Cam和小窝蛋白-1相关mRNA表达量，和检测eNOS、Cam和小窝蛋白-1三种蛋白量。
2.根据权利要求1所述的ERβ基因缺陷对eNOS-NO通路表达影响的检测方法，其特征在于：所述eNOS、Cam和小窝蛋白-1相关mRNA表达量的检测，包括如下步骤：
1) 组织总RNA的提取：
A. 选择刚刚死亡的ERβ缺陷型动物和正常动物，取部分阴茎中段组织冻存于液氮中，检测时从液氮中取冻存的阴茎组织，加入0.5 ml TRIzol试剂和液氮，充分研磨，直至阴茎组织成粉末状，最后补加0.5 ml TRIzol试剂，室温下静置5 min，保证样品体积不应超过TRIzol体积的10％，然后于4 ℃，12000×g离心15 min；
B. 取上清液置另一EP管中，每管加入0.2 ml氯仿，剧烈震荡15 s混匀；
C. 将匀浆的样品在室温下放置2～3 min，使核酸蛋白复合物完全分离，然后于 4 ℃，12000 ×g离心15 min；
D. 经离心后的样品分为三层，底层为黄色的有机相，上层为无色的水相和一个中间层，RNA主要存在于水相中，将水相转移到新的EP管中，加入等体积的异丙醇沉淀水相中的RNA，混匀并于室温放置10 min；
E. 于4 ℃，12000 ×g离心10 min，离心管底部会出现胶状RNA沉淀；
F. 移去上清，每管加入1 ml 75% 的乙醇洗涤RNA沉淀，混匀，于4 ℃，7600×g离心5 min；
G. 移去上清，沉淀在室温下干燥10 min，用适量的DEPC水溶解RNA沉淀, 用分光光度计测其浓度及纯度，取适量总RNA稀释后测定A260和A280的比值，计算RNA的浓度；
H. 取8 μl RNA样品用1.0%琼脂糖进行电泳，观察RNA的完整性；
2）反转录：
使用Fermentas第一链cDNA合成试剂盒进行反转录反应，反应体系如下：
 5×Reactionbuffer4.0μl10mmol/LdNTP2.0μlOlig(dT)18引物1.0μlRNA酶抑制剂1.0μlM-MuLV反转录酶(200U/μl)1.0μlRNA模板1μg无核酶水补至20μl反应条件为：42 ℃反应60 min，70 ℃ 5 min 灭活，产物于-20 ℃保存待用；
3）聚合酶链式反应
在Genbank上查找小鼠Cam、caveolin-1、eNOS及β-actin的mRNA序列，取其保守区，使用primer 5.0软件对引物进行设计，引物序列为：
 
反应体系如下：
2×Taq酶PCR反应混合液12.5μl引物1(20μmol/L)1.5μl引物2(20μmol/L)1.5μlcDNA模板2.0μlddH2O7.5μl反应条件为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，退火30 s，72 ℃延伸时间30 s，30～35 个循环，72 ℃延伸10 min；
4）电泳及观察分析
PCR产物采用10 V/cm的电压，在1%琼脂糖凝胶上电泳，电泳完成后, 采用凝胶电泳成像分析系统观察、拍照，用Quantity-One软件分析目的基因和内参基因，即β-actin的灰度，以目的基因/β-actin的比值表示目的基因的相对表达量。
3.根据权利要求1所述的ERβ基因缺陷对eNOS-NO通路表达影响的检测方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘连军，马洁桦，
申请(专利权)人：南京市妇幼保健院，
类型：发明
国别省市：