本发明专利技术公开了一种通用的CaMV（花椰菜花叶病毒）35S启动子定量检测方法，涉及分子生物学及转基因检测技术领域。本定量检测方法是：①收集CaMV35S启动子增强子保守区序列；②利用该序列特征设计引物探针；③PCR扩增；④建立标准曲线；⑤定量体系的精确性验证。本发明专利技术避免了现有一些CaMV35S启动子检测方法存在的检测引物/探针与检测靶标序列不完全匹配的问题；避免了现有一些CaMV35S启动子检测方法存在的两侧引物结合位点数不同而引起的多条扩增产物的问题；适用于含有CaMV35S启动子的转基因油菜、水稻、大豆等转基因作物的定量检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学及转基因检测
，尤其涉及一种通用的CaMV（花椰菜花叶病毒）35S启动子定量检测方法。 具体地说，本专利技术是比对收集到的不同来源的CaMV 35S启动子序列得到增强子序列中较长的保守区，设计以增强子保守区为检测靶标序列的引物探针，筛选出特异性强、灵敏度高的CaMV 35S启动子检测方法。其应用是该方法可适用于CaMV 35S启动子筛查原件的的检测，并解决了原有CaMV 35S启动子检测系统中一些检测方法存在的与检测靶标的匹配性不完全匹配以及存在多条扩增产物等一些无法解决的问题。
技术介绍
近年来，玉米、大豆、棉花、油菜和番茄等转基因作物已在很多国家获准种植和生产，有的被加工成食品、饲料或用作食品添加剂。由于转基因产品的生态安全和食用安全一直备受争议，30多个国家和地区相继实施转基因产品标识制度。 转基因检测方法，根据检测靶标的不同，分为载体特异性检测、转化事件特异性检测和筛查检测的方法。 载体特异性检测方法利用基因元件之间的边界序列特征，能够有效鉴定使用类似基因元件的不同构建体，而且存在序列信息容易获得的特点，因此被很多研究者所使用。但是，由同一构建体可能获得不止一个不同特性的转化株，甚至可能被转化到不同的物种中，而这些转化株未必全部经过了安全评估。因此载体特异性检测方法不能识别不同的转基因品系，也不能判别该转基因品系是否已经过安全评估。 事件特异性检测的基础是转基因构建体在基因组DNA序列上的整合位点具 有高度特异性，即使是相同的载体多次转化，整合的位置和整合位点特征也是不可重复的。因此，根据不可重复的整合位点特征序列，开发出了事件特异性的检测方法。与前两种方法相比，事件特异性检测具有最高的特异性，最适合做转基因产品的定性和定量检测。但转基因构建体的完整信息通常难以获得，而已知序列基因元件可能距边界有相当的距离，而且在整合的过程中，载体和基因组之间可能发生复杂的重组，因此，分离旁侧序列成为事件特异性检测的关键。 筛查方法具有最低的特异性，其追求的是对不同转基因品种的高覆盖率。因此转基因筛查方法往往选择最常用的转基因元件作为筛查靶标。来自CaMV的35S蛋白基因启动子和来自农杆菌Ti质粒NOS基因的终止子是最为常用的转基因元件。这两个元件广泛存在于各种商业化转基因作物和各种用于研究的转基因载体系统。因为以上原因，CaMV 35S启动子和NOS终止子是应用最广泛的最基本的筛查元件。在众多的法规和研究论文中，不同机构和研究者提够了各种不同的筛查检测方法。但是，在我们的实践中，我们发现与NOS终止子的检测方法相比，CaMV 35S启动子的很多方法在很多品种的检测中存在这样那样的问题。事实上CaMV 35S启动子是被改造得最为严重的转基因元件之一，不同转基因品种中的CaMV 35S启动子的序列可能千差万别。利用某一方法对不同品种中的CaMV 35S启动子进行检测也可能产生完全不同的检测结果，造成阴性结果、非特异扩增和灵敏度下降等严重问题。以上问题影响了CaMV 35S启动子作为筛查元件的可靠性，并给转基因筛查工作造成了困难。
技术实现思路
本专利技术的目的就在于克服现有转基因筛查技术中CaMV 35S启动子检测方法在检测工作中存在的不足，提供一种通用的CaMV 35S启动子定量检测方法。 本专利技术的目的是这样实现的： 一、一种通用的CaMV 35S启动子定量检测方法 本方法包括下列步骤： ①收集CaMV 35S启动子增强子保守区序列： 收集GMDD（GMO Detection Method Database，转基因检测方法数据库，http://gmdd.shgmo.org/）所公布的不同转化事件来源的CaMV 35S启动子序列， 通过其序列比对结果，以其增强子序列的保守区为检测靶标，其序列特征是： 由来源于野生型CaMV 35S启动子第7018至7344个碱基组成，如图1所示： ②利用该序列特征设计引物探针： a、合成引物序列如下： 35SEnhF187：5’CATCATTGCGATAAAGGAAAGGC 3’和35SEnhR311：5’TGCTTTGAAGACGTGGTTGGA 3’； b、合成TaqMan探针序列如下： 35SEnhFP230：5’FAM－CCGACAGTGGTCCCAAAGATGG－BHQ13’； ③PCR扩增： 提取样品总DNA，分别利用上述引物35SEnhF187/35SEnhR311和探针35SEnhFP230组合进行荧光定量PCR扩增； ④建立标准曲线： 以含有CaMV 35S启动子的转基因油菜OXY235基因组DNA为研究模型，利用相同浓度非转基因油菜基因组DNA稀释至不同含量，以100ng的混和油菜基因组DNA为模板，进行荧光定量PCR反应并建立标准曲线； ⑤定量体系的精确性验证： 以标准曲线为参照测定含有OXY235基因组DNA的混和油菜基因组DNA样品中CaMV 35S启动子的量。 工作机理： 本检测方法的建立必须包括特异性分析、灵敏度分析以及将待测样品的Ct值代入已知浓度DNA建立的标准曲线，根据标准曲线计算出待测样品Ct值对应的拷贝数来进行精确性验证，本方法均有涉及并且经实验验证，具有很高的精确度。 二、应用 应用于含有CaMV 35S启动子的转基因作物的定量检测 已经实验验证的可进行定量检测的转基因作物包括：转基因油菜OXY235和Topas19/2；转基因水稻科丰6号和克螟稻；转基因大豆A2704-12和A5547-127。 与现有CaMV 35S启动子检测方法相比，本专利技术具有下列优点和积极效果： 1、避免了现有一些CaMV 35S启动子检测方法存在的检测引物/探针与检测 靶标序列不完全匹配的问题； 2、避免了现有一些CaMV 35S启动子检测方法存在的两侧引物结合位点数不同而引起的多条扩增产物的问题； 3、适用于含有CaMV 35S启动子的转基因油菜、水稻、大豆等转基因作物的定量检测。 附图说明图1是CaMV 35S启动子增强子序列的保守区序列结构图； 图2是本方法定量检测引物探针及其位置图； 图3是本方法检测不同浓度转基因油菜OXY235定量扩增曲线图； 图4是本方法检测不同浓度转基因油菜OXY235定量扩增标准曲线图； 图5是本方法检测转基因油菜OXY235定量扩增曲线图； 图6是本方法检测转基因油菜Topas19/2定量扩增曲线图； 图7是本方法检测转基因水稻科丰6号定量扩增曲线图； 图8是本方法检测转基因水稻克螟稻定量扩增曲线图； 图9是本方法检测转基因大豆A2704-12定量扩增曲线图； 图10是本方法检测转基因大豆A5547-127定量扩增曲线图。 具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术详细说明： 一、定量检本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种通用CaMV？35S启动子定量检测方法，其特征在于：①收集CaMV？35S启动子增强子保守区序列：收集GMDD（GMO？Detection？Method？Database，转基因检测方法数据库，http://gmdd.shgmo.org/）所公布的不同转化事件来源的CaMV？35S启动子序列，通过其序列比对结果，以其增强子序列的保守区为检测靶标，其序列特征是：由来源于野生型CaMV？35S启动子第7018至7344个碱基组成，如图1所示：②利用该序列特征设计引物探针：a、合成引物序列如下：35SEnhF187：5’CATCATTGCGATAAAGGAAAGGC？3’和35SEnhR311：5’TGCTTTGAAGACGTGGTTGGA？3’；b、合成TaqMan探针序列如下：35SEnhFP230：5’FAM－CCGACAGTGGTCCCAAAGATGG－BHQ13’；③PCR扩增：提取样品总DNA，分别利用上述引物35SEnhF187/35SEnhR311和探针35SEnhFP230组合进行荧光定量PCR扩增；④建立标准曲线：以含有CaMV？35S启动子的转基因油菜OXY235基因组DNA为研究模型，利用相同浓度非转基因油菜基因组DNA稀释至不同含量，以100ng的混和油菜基因组DNA为模板，进行荧光定量PCR反应并建立标准曲线；⑤定量体系的精确性验证：以标准曲线为参照测定含有OXY235基因组DNA的混和油菜基因组DNA样品中CaMV？35S启动子的量。...
【技术特征摘要】
1.一种通用CaMV 35S启动子定量检测方法，其特征在于：
①收集CaMV 35S启动子增强子保守区序列：
收集GMDD（GMO Detection Method Database，转基因检测方法数据库，
http://gmdd.shgmo.org/）所公布的不同转化事件来源的CaMV 35S启动子序列，
通过其序列比对结果，以其增强子序列的保守区为检测靶标，其序列特征是：
由来源于野生型CaMV 35S启动子第7018至7344个碱基组成，如图1所示：
②利用该序列特征设计引物探针：
a、合成引物序列如下：
35SEnhF187：5’CATCATTGCGATAAAGGAAAGGC 3’和35SEnhR311：5’
TGCTTTGAAGACGTGGTTGGA 3’...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴刚，李伟，李晓飞，张丽，
申请(专利权)人：中国农业科学院油料作物研究所，
类型：发明
国别省市：
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