本发明专利技术公开了一种芝麻栽培种与Sesame?radiatum野生种远缘杂交后代的分子鉴定方法，属生物技术领域。通过提取栽培种（Sesame?indicum?L.,2n=26）、野生种（Sesame?radiatum,2n=64）及杂交后代F1的基因组DNA，进行PCR扩增和凝胶电泳检测，根据是否能够同时扩增出亲本的特异性条带判定远缘杂交F1代的真假。本发明专利技术建立的芝麻远缘杂交后代的分子鉴定方法，解决了芝麻远缘杂交育种研究过程中的远缘杂种鉴定周期长、准确率低等难题，填补了我国芝麻远缘杂交育种技术的空白。利用该方法可以高效快速地鉴定芝麻远缘杂交后代F1，为芝麻抗病新品种育种奠定了材料和技术基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种植物杂交后代的分子鉴定方法，特别是涉及一种芝麻栽培种（2n=26）与野生种（Sesame radiatum，2n=64）远缘杂交后代的分子鉴定方法，属于生物
技术介绍
芝麻（Sesame indicumL.，2n=26）属胡麻科胡麻属，是世界上最古老的特色油料作物之一。芝麻在我国已有三千多年的栽培历史，因品质优良，在国际生产和贸易中占有重要地位。然而，由于芝麻抗病耐渍性较差，易受环境条件的影响，产量的稳产性不佳。近二十年来，开展高产稳产抗病抗逆新品种选育一直是我国芝麻遗传育种的一项重点任务。 芝麻野生种（Sesame radiatum，2n=64）具有较好的抗病抗逆特性，将野生种的抗病抗逆特性转入栽培种，是提高芝麻品种抗性特征的重要技术途径。但是由于芝麻远缘杂交不具有亲和性，后代几乎不能自交结实，目前只能采用幼胚拯救培养、组培苗移栽方式获得远缘杂交后代。在远缘杂交后代鉴定方面，受研究技术限制，目前仅采用外观形态、生物学等鉴定方法判断芝麻远缘杂交F1代的真伪。研究发现，与实生苗不同的是，芝麻远缘杂交后代组培苗之间在外观形态方面差异不明显，但与亲本的差异都很显著。因此选用外观形态、生物学等方法对远缘杂交后代进行鉴定，结果可靠性较差，且鉴定周期较长。因此，目前急需建立一种快速稳定高效的芝麻远缘杂交后代的鉴定方法，为完善芝麻远缘杂交育种技术、加快芝麻远缘杂交育种步伐提供技术支撑。 DNA是生物的遗传物质，DNA的多态性是生物多样性的本质内容。目前，随着分子标记技术的不断发展和广泛应用，国内外在植物杂交育种的后代鉴定中越来越多的应用各种分子标记技术，如RAPD、ISSR、AFLP、SSR等分子标记。与常规育种相比，分子标记可以直接以DNA的形式表现，在生物体的各个组织、各个发育阶段均可检测到，不受季节、环境限制，也不存在表达与否等问题。其中，SSR标记由于其多态性高、共显性和稳定性好、染色体位置清楚而得到了广泛应用，紧密连锁的SSR标记可用于标记辅助选择和联合育种，在应用分子标记进行杂交后代真实性的鉴定过程中特异性的引物是关键所在。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种芝麻栽培种与Sesame radiatum野生种远缘杂交后代的分子鉴定方法。 为了实现以上目的，本专利技术所采用的技术方案是： 检测芝麻远缘杂交后代的SSR引物，包括： 引物对HS209 正向引物序列：5’-GCAAGAAGCCGACATGTTTA-3’（Tm=53.35℃） 反向引物序列：5’-ACTCCAATTCCTCCACCAAG-3’（Tm=55.4℃）。 上述引物用于芝麻栽培种与Sesame radiatum野生种远缘杂交后代的分子鉴定方法，具体步骤如下： （1）挑选饱满健康的芝麻栽培种与Sesame radiatum野生种种子，6月播种后于7月下旬植株进入花期，进行人工授粉杂交，采用组织培养方法对杂交后代幼胚进行培养，获得远缘杂交F1后代； （2）提取步骤（1）中芝麻栽培种（Sesame indicum L.,2n=26）、野生种（Sesame radiatum,2n=64）及杂交后代F1基因组DNA，作为模板备用； （3）将步骤（2）提取的DNA模板应用于PCR反应体系，运行PCR扩增程序，在引物对HS209的引导下，得到PCR反应产物； （4）将步骤（3）的PCR反应产物进行凝胶电泳检测，检测结果有栽培种特异性条带210bp和野生种特异性条带200bp、230bp的为真杂种；其余则为假杂种。 所述的芝麻亲本及杂交后代基因组DNA的提取方法：采取CTAB提取法，取植株叶片，加入预冷的提取缓冲液，研磨，4℃离心，弃上清，于沉淀中加入预热的裂解缓冲液，65℃水浴，加入氯仿/异戊醇混合液，混匀，15℃离心，取上清，加预冷的异丙醇，混匀，静置，离心，弃上清，于沉淀中加入乙醇洗涤，离心，倒掉上清后干燥，加TE缓冲液，4℃溶解DNA30min以上，于20℃保存备用。 所述的提取缓冲液包括：0.35M Glucose，0.1M Tris-HCl，5mM Na-EDTA，2%PVP，1%(V/V)β-Me，余量为无菌超纯水，4℃保存。 所述的裂解缓冲液包括：1.4M NaCl，0.1M Tris-HCl，20mM Na-EDTA，2%CTAB，2%PVP，1%(V/V)β-Me，余量为无菌超纯水，室温保存。 所述的TE缓冲液包括：10mM Tris-HCl(PH 8.0)，1mM EDTA(PH 8.0)，余量为无菌超纯水。 所述的PCR反应体系为：DNA模版50ng，10×Buffer 1μL，10mmol·L-1dNTPs 0.2μL，10μg·L-1引物对HS2091μL，2.5U·μL-1Taq DNA polymerase 0.5μL，加入无菌超纯水至 终体积10μL。 所述的PCR扩增程序为：94℃变性3min，94℃变性l min，58℃退火45s，72℃延伸60s，30个循环，72℃总延伸10min；4℃保存。 所述的凝胶电泳检测为：采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶浓度10%，电泳缓冲液为1×TBE，150V恒压电泳2小时，电泳结束后，凝固定先胶，再银染，漂洗，显色，漂洗凝胶后记录读取数据。 本专利技术的有益效果： （1）HS209SSR标记为自主开发的种间特异性标记（GenBank,JP643611），结果稳定可靠。 （2）试验开展不受芝麻生产季节限制，可以以芝麻幼苗叶片为材料，用材少、周期短，材料的预处理及试验操作步骤简便易行。 （3）采用SSR标记技术对野生种与栽培种芝麻的远缘杂交后代进行鉴定，填补了芝麻远缘杂交后代分子生物学鉴定技术的空白。与流式细胞仪细胞学检测方法相比，该方法不需要基因组参照材料，数据更加稳定可靠；此外，本专利技术技术要点均属常规生物学技术方法，成本低，在短时间内可完成大批试验材料的鉴定。可广泛用于今后的芝麻种质创新、远缘杂交育种等研究。 附图说明图1远缘杂交后代组培苗F1田间长势； 图2亲本与芝麻远缘杂交后代的SSR标记鉴定电泳图； 注：1：Marker DL2000；2：豫芝11；3：野芝1号；4：真杂种F1No.IH 07；5：真杂种F1No.IH25；6：假杂种F1No.IH 01；7：假杂种F1No.IH 13。 具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作详细说明，但不构成对本专利技术的任何限制。 实施例 本实施例用于芝麻豫芝11号（Sesame indicum L.,2n=26）和野芝1号（Sesame radiatum,2n=64）杂交F1代的鉴定，具体操作步骤如下： （1）远缘杂交亲本及后代培养：挑选饱满健康的芝麻豫芝11号（Sesame indicum L.,2n=26）和野芝1号（Sesame radiatum,2n=64）种子，6月播种后于7月下旬植株进入花期，进行人工本文档来自技高网...
【技术保护点】
检测芝麻栽培种与Sesame？radiatum野生种远缘杂交后代的的SSR引物，包括：引物对HS209正向引物序列：5’？GCAAGAAGCCGACATGTTTA？3’（Tm=53.35℃）反向引物序列：5’？ACTCCAATTCCTCCACCAAG？3’（Tm=55.4℃）。
【技术特征摘要】
1.检测芝麻栽培种与Sesame radiatum野生种远缘杂交后代的的SSR引物，包括：
引物对HS209
正向引物序列：5’-GCAAGAAGCCGACATGTTTA-3’（Tm=53.35℃）
反向引物序列：5’-ACTCCAATTCCTCCACCAAG-3’（Tm=55.4℃）。
2.一种如权利要求1所述的引物用于芝麻栽培种与Sesame radiatum野生种远缘杂交
后代的分子鉴定方法，其特征在于，具体步骤如下：
（1）挑选饱满健康的芝麻栽培种（Sesame indicum L.,2n=26）与野生种（Sesame
radiatum,2n=64）种子，6月播种后于7月下旬植株进入花期，进行人工授粉杂交，采用
组织培养方法对杂交后代幼胚进行培养，获得远缘杂交F1后代；
（2）提取步骤（1）中芝麻栽培种（Sesame indicum L.,2n=26）、野生种（Sesame radiatum,
2n=64）及杂交后代F1基因组DNA，作为模板备用；
（3）将步骤（2）提取的DNA模板应用于PCR反应体系，运行PCR扩增程序，在引
物对HS209的引导下，得到PCR反应产物；
（4）将步骤（3）的PCR反应产物进行凝胶电泳检测，检测结果有栽培种特异性条带
210bp和野生种特异性条带200bp、230bp的为真杂种；其余则为假杂种。
3.根据权利要求2所述的分子鉴定方法，其特征在于，所述的基因组DNA的提取方
法：取植株叶片，加入预冷的提取缓冲液，研磨，4℃离心，弃上清，于沉淀中加入预热
的裂解缓冲液，65℃水浴，加入氯仿/异戊醇混合液，混匀，15℃离心，取上清，加预冷的
异丙醇，混匀，静置，离心，弃上清，于沉淀...
【专利技术属性】
技术研发人员：张海洋，苗红梅，张体德，魏利斌，李春，琚铭，王慧丽，
申请(专利权)人：河南省农业科学院，
类型：发明
国别省市：
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