本发明专利技术涉及一种检测CLLU1基因mRNA表达量的试剂盒，属于生物技术领域，所述试剂盒包含检测用引物、荧光探针、cDNA第一链合成试剂、荧光定量PCR混合液、阴性对照和阳性对照，所述检测用引物、荧光探针包括CLLU1基因引物、内参基因ABL引物及Taqman荧光探针。CLLU1基因的高度表达与慢性淋巴细胞白血病治疗时间长短以及患者总生存期低密切相关，且CLLU1基因的表达水平与已知慢性淋巴细胞白血病不良预后因素有密切关系。采用敏感性及特异性均较高的荧光定量PCR技术检测CLLU1基因mRNA水平，其检测结果的特异性和敏感度均显著提高。本发明专利技术实施例提供的试剂盒为预测慢性淋巴细胞白血病的预后以及化疗方案的确定提供了一种全新的快速简便的基因诊断技术。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
的荧光定量PCR技术，具体涉及一种检测CLLU1基因mRNA表达量的试剂盒。
技术介绍
慢性淋巴细胞白血病（The chronic lymphocytic leukemia upregulated，CLL）是一种成熟B淋巴细胞克隆增殖性肿瘤，以淋巴细胞在外周血、骨髓、脾脏和淋巴结聚集为特征。CLL是成人最常见白血病之一，约占所有白血病的四分之一。CLL在西方国家发病率较高，男性发病率可达3/10万人口以上，女性也接近2/10万人口，但在我国、日本及东南亚国家发病率较低。CLL是一种成年人的疾病，但是，在极少数情况下，它可以发生在青少年中，偶见于儿童。新诊断的CLL患者大多数（>75％）为50岁以上，多数是男性。CLL患者是一个异质性群体，在发病的形式、疾病进展、治疗反应和生存期方面具有明显的个体差异。近年来Buhl等人通过差异显示的方法发现了位于12q22区域的新基因：慢性淋巴细胞白血病上调基因1（CLL upregulated gene 1，CLLU1）在CLL细胞中呈特异性表达。CLLU1基因被认为是最新的CLL的预后指标，该基因对于CLL显示出具有特异性，CLLU1基因转录产物仅见于CLL细胞中，CLL细胞的CLLU1基因表现出高度的表达水平。目前，对于CLLU1基因的具体功能尚不完全清楚，经研究表明，这种基因的高度表达与治疗时间长短以及70岁以下的患者总生存期低密切相关，且CLLU1基因表达水平与已知CLL不良预后因素有密切关系。CLLU1基因表达可以显着提高其他技术，如：FISH（荧光原位杂交）、IgVH突变分析、CD38和ZAP-70，特别是IgVH突变，来评估CLL患者预后的价值。目前可用探针杂交法、质谱法、定性PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）法、基因测序法和流式细胞术等方法对CLLU1基因定量的表达进行检测。探针杂交法假阳性率较高；基因芯片法成本高、制备方法繁琐；基因测序法的敏感性和特异性高，但价格比较昂贵，而且操作繁琐，耗时长；流式细胞术涉及多环节，操作复杂，分析报告带有一定的主观性；定性PCR法具有特异性强和灵敏度高等优点。但实时荧光定量PCR技术实现了PCR从定性到真正意义的定量的飞跃，为人类疾病基因的定量检测提供了一个行之有效的检测工具，与普通PCR相比具有特异性增强、灵敏度提高和检测快速、降低了污染等特点，但目前尚未有实时荧光定量PCR方法检测慢性淋巴细胞白血病中的CLLU1基因的相关报道。
技术实现思路
为了解决现有技术的问题，本专利技术实施例提供了一种检测CLLU1基因mRNA表达量的试剂盒。所述技术方案如下：本专利技术所提供的检测AML1-ETO融合基因mRNA表达量的试剂盒，包括检测用引物、荧光探针、cDNA第一链合成试剂、荧光定量PCR混合液、阴性对照和阳性对照，所述检测用引物、荧光探针包括CLLU1基因引物、内参基因ABL引物及Taqman荧光探针，其中：CLLU1基因上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:1所示；CLLU1基因下游引物序列如序列表中SEQ ID NO:2所示；CLLU1基因Taqman荧光探针如序列表中SEQ ID NO:3所示；ABL基因上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:4所示；ABL基因下游引物序列如序列表中SEQ ID NO:5所示；ABL基因Taqman荧光探针如序列表中SEQ ID NO:6所示；所述cDNA第一链合成试剂含有MgC12、逆转录酶缓冲液、dNTPs、RNA酶抑制剂、Oligo(dT)15、AMV逆转录酶和无RNase去离子水；所述荧光定量PCR混合液含有PCR预混合液、Mg2+、dNTPs、dUTP、Taq酶、UNG酶和无RNase去离子水。进一步地，所述试剂盒还包括内部阳性控制序列、内部阳性控制序列的引物和Taqman荧光探针，其中：内部阳性控制序列如序列表中SEQ ID NO:7所示；内部阳性控制序列的上游引物如序列表中SEQ ID NO:8所示；内部阳性控制序列的下游引物如序列表中SEQ IDNO:9所示；内部阳性控制序列的Taqman荧光探针如序列表中SEQ ID NO:10所示。进一步地，所述CLLU1基因的Taqman荧光探针和ABL基因的Taqman荧光探针的5’端连接有荧光报告基团FAM，3’端均连接有荧光淬灭基团TAMRA；所述内部阳性控制序列的Taqman荧光探针的5’端连接有荧光报告基团TET，3’端连接有荧光淬灭基团TAMRA。具体地，所述内参基因ABL的核酸序列如序列表中SEQ ID NO:11所示。具体地，所述阴性对照为去离子水；所述阳性对照为含有CLLU1基因的总RNA样品。具体地，所述cDNA第一链合成试剂为：25mmol/L MgCl2 4μL，10×逆转录酶缓冲液2μL，10mmol/L dNTP 2μL，RNA酶抑制剂0.5μL，Oligo(dT)150.5μg，AMV逆转录酶1.5U和无RNase去离子水，总体积11μL。具体地，所述荧光定量PCR的混合液（以反应体系终浓度表示）为：1×的PCR预混合液（原液为2×PCR Premix）、2.5-4.0mM的Mg2+、0.2-0.4mM的dNTPs、0.3-0.6mM的dUTP、0.2U/μL的Taq酶和0.01-0.05U/μL的UNG酶以及无RNase去离子水。本专利技术试剂盒的优点和效果如下：（1）敏感性高：可重复敏感度为0.01%，即10000个细胞中有一个含CLLU1基因就可以被检测出。（2）特异性强：使用特异性探针对定量分子进行识别，准确性高。同时，靶序列由引物和探针双重控制，特异性好、假阳性低。（3）简便安全：操作简单、安全、自动化程度高而且防止污染。扩增和检测可以在同一管内检测，不需要开盖，不易被污染；同时扩增和检测一步完成，不需要后期处理，无需要担心放射性污染。（4）全程监控：本专利技术实施例提供的试剂盒引入了内部阳性控制质量控制体系，对检测过程进行全程质量监控，有效避免假阳性或者假阴性。（5）快速：速度快、高通量，可在3-4小时完成。本专利技术的试剂盒能快速、准确、定量检测CLLU1基因mRNA水平，有效杜绝了假阳性和假阴性的发生，用于慢性淋巴细胞白血病的治疗及预后评价，为慢性淋巴细胞白血病的制定治疗方案及预后提供了重要的检测手段。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测CLLU1基因mRNA表达量的试剂盒，包含检测用引物、荧光探针、cDNA第一链合成试剂、荧光定量PCR混合液、阴性对照和阳性对照，其特征在于，所述检测用引物、荧光探针包括CLLU1基因引物、内参基因ABL引物及Taqman荧光探针，其中：CLLU1基因上游引物序列如序列表中SEQ？ID？NO:1所示；CLLU1基因下游引物序列如序列表中SEQ？ID？NO:2所示；CLLU1基因Taqman荧光探针如序列表中SEQ？ID？NO:3所示；ABL基因上游引物序列如序列表中SEQ？ID？NO:4所示；ABL基因下游引物序列如序列表中SEQ？ID？NO:5所示；ABL基因Taqman荧光探针如序列表中SEQ？ID？NO:6所示；所述cDNA第一链合成试剂含有MgC12、逆转录酶缓冲液、dNTPs、RNA酶抑制剂、Oligo(dT)15、AMV逆转录酶和无RNase去离子水；所述荧光定量PCR混合液含有PCR预混合液、Mg2+、dNTPs、dUTP、Taq酶、UNG酶和无RNase去离子水。
【技术特征摘要】
2012.09.29 CN 201210376556.11.一种检测CLLU1基因mRNA表达量的试剂盒，包含检测用引物、荧光探针、cDNA
第一链合成试剂、荧光定量PCR混合液、阴性对照和阳性对照，其特征在于，所述检测用引
物、荧光探针包括CLLU1基因引物、内参基因ABL引物及Taqman荧光探针，其中：
CLLU1基因上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:1所示；
CLLU1基因下游引物序列如序列表中SEQ ID NO:2所示；
CLLU1基因Taqman荧光探针如序列表中SEQ ID NO:3所示；
ABL基因上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:4所示；
ABL基因下游引物序列如序列表中SEQ ID NO:5所示；
ABL基因Taqman荧光探针如序列表中SEQ ID NO:6所示；
所述cDNA第一链合成试剂含有MgC12、逆转录酶缓冲液、dNTPs、RNA酶抑制剂、
Oligo(dT)15、AMV逆转录酶和无RNase去离子水；所述荧光定量PCR混合液含有PCR预
混合液、Mg2+、dNTPs、dUTP、Taq酶、UNG酶和无RNase去离子水。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括内部阳性控制序列、
内部阳性控制序列的引物和Taqman荧光探针，其中：内部阳性控制序列如序列表中SEQ ID
NO:7所示；内部阳性控制序列的上游引物如序列表中SEQ ID NO:8所示；内部阳...
【专利技术属性】
技术研发人员：李艳，童永清，
申请(专利权)人：李艳，童永清，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。