一种检验鉴别遗传性心肌肥厚相关基因突变的试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种检测遗传性心肌肥厚相关基因突变样品制备试剂盒。具体的涉及一种应用大规模平行测序平台技术检测遗传性心肌肥厚相关基因的产品，该试剂盒包括a)独特设计并制备捕获探针，针对基因ACTC1、ACTN2、BRAF、CALR3、CASQ2、CSRP3、GLA、HRAS、JPH2、KRAS、LAMP2、LDB3、MAP2K1、MYBPC3、MYH6、MYH7、MYL2、MYL3、MYLK2、MYOZ2、PRKAG2、RAF1、SOS1、TCAP、TNNC1、TNNI3、TNNT2、TPM1、TTN、TTR、VCL全部外显子片段；b)设计独特带有标签序列的接头；c)通用引物对探针序列进行PCR扩增；d)设计独特的混合后目的片段的捕获操作。这个方法和试剂盒制备的大规模平行测序平台样品通量大、效率高、操作简便，极大地降低了测序检验成本。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学领域，涉及医学诊断和生物技术，涉及一种检测肥厚型心肌病相关基因突变的体外诊断试剂盒，具体的是一种采用大规模平行测序平台技术检验鉴别遗传性心肌肥厚相关基因突变的试剂盒。 技术背景心室肌肥厚是一种症状或者说是一种临床表现，并不是病名.关于心室肌肥厚，定义就是在心脏中，心室心肌形态上发生变化，数量上增加，造成心室室壁的增厚，而心室的室腔相对空间减小，血容量减少。对于造成心室肌肥厚的原因有多种，比如高血压，冠心病，肥厚性心肌病，瓣膜病(如主动脉关闭不全)等.除了上述原因外，还有一些遗传因素造成的代谢障碍、心肌发育过程障碍也会引起心肌肥厚。这些疾病多数起病隐匿、临床表现相似，物理检查差异不大，但是治疗方法和预后方面存在巨大的差异。 最常见的遗传性心肌肥厚的原因是肥厚型心肌病。肥厚型心肌病(HCM)是一种原发性的心肌疾病，表现为不明原因的左心室和/或右心室以及室间隔非对称性的肥厚。它的病理学特征是肥厚心肌细胞紊乱。临床表现多样，可以无症状，亦可表现为心衰、心律失常、猝死等恶性心脏事件，是年轻人心源性猝死的首位病因，年死亡率1-6％。过去认为HCM是一种罕见的心脏疾病。但近年流行病学调查显示白人HCM的发病率高达0.2％。而我国HCM患者超过200万。可见HCM不再是所谓的罕见疾病。巨大的患病群体和严重的临床预后以及患者带病生存的质量差，造成了巨大的社会和家庭负担。 西方发达国家20年前就系统地开展了HCM分子遗传学研究，已公认的遗传度最高的心血管疾病，并明确HCM为常染色体显性遗传的单基因疾病，即后代只要继承了父母任何一方(患病者)的含突变基因的染色体即可能发病。已经发现至少15个突变基因、超过700个位点突变是HCM的病因。 对于心肌肥厚疾病的鉴别诊断传统的方法主要依靠临床表现、心电图、超 声心动图和心脏核磁。这些手段存在很大的缺点：1.心室肥厚出现时间差异性大，早期无肥厚，有的出现肥厚需几十年时间；2.导致心室肥厚因素众多，不仅有时与高血压难以鉴别，还有很多疾病表现出与HCM完全一致的心脏大体形态学特点，例如Fabry病是一个性连锁遗传的溶酶体Ot.半乳糖奇酶缺乏性疾病。此病属于性连锁遗传，致病基因定位在Xq22，目前已经在此基因区内发现了150个基因突变，其中错义点突变75％，基因缺失占15％，多数家族表现为个体基因突变。临床研究证明有6.3％的年龄超过40以上发病的肥厚性心肌病患者属于Fabry病。而Fabry病不需要手术干预，只要药物替代治疗可以的。并且Fabry病发生心源性猝死的风险要远远低于肥厚型心肌病。故传统诊断方法面临明确诊断时间晚(症状出现后)、容易发生误诊、难以判断预后等问题。 基因诊断的优势在于：一是特异性高，旦明确致病基因突变，就是100％确诊；二是早期诊断，即可在症状出现前或不可逆病理改变前作出诊断；三是能够根据基因型判断良恶性临床转归和预后，提供针对性的“个体化治疗”；四是可根据基因型提供遗传咨询和生育指导。这一切都揭示了基因诊断在临床上有巨大的应用前景。 由于遗传性的心肌肥厚性疾病涉及的病种多、基因多、突变位点多。如何经济有效的进行基因诊断是非常困难的。传统的PCR、多重PCR、第一代自动测序仪测序都只是针对少量的位点筛查可行。但是面对遗传性的心肌肥厚涉及如此多的的已知突变位点和大量未知潜在突变位点的诊断目标时，这些方法就暴露出时间长、成本高、操作难度大的软肋。 近年，大规模DNA平行测序平台(massively parallel DNA sequencing platform)已经发展为主流的测序技术，这项测序技术的出现不仅令DNA测序费用降到了以前的百分之一，还让基因组测序这项以前专属于大型测序中心的“特权”能够被众多研究人员分享。利用这种平台更能轻松地把病人所有涉及心肌细胞发育和功能的基因完整检测出来，使HCM这类复杂遗传性疾病的基因诊断成为可能。 但是直接使用大规模DNA平行测序平台检测的成本目前仍然令个人难以承受。本专利技术可以同时把多个甚至几十病人的遗传性的心肌肥厚相关基因 精确的选择性捕获，然后用于大规模测序平台，可以进一步极大地降低基因诊断的成本，使之广泛应用于临床成为可能。 
技术实现思路
本专利技术的目的是，提供一种检测遗传性的心肌肥厚相关基因突变的多重目标捕获再测序的试剂盒。该试剂盒提高了基因捕获的通量和基因平行测序的通量，操作简便、成本低。 为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：一种新的多重目标捕获再测序方法，包括以下步骤： a.设计并制备用于捕获遗传性的心肌肥厚相关基因的突变捕获探针。并将这些探针结合在磁珠、薄膜或者玻片上。 b.将待测基因组DNA样品分别片段化至100-400bp，然后将末端补平，加入的ATP使片段两端引入粘性末端。 c.分别加入设计好的一端带有标签序列的接头序列片段，加入连接酶，使每个片段都与一对接头连接，形成新的片段。标签序列的设定位置在接头的粘性末端。标签序列的设计见表1。 d.调节反应温度激活DNA聚合酶，用一对标准引物，对步骤c所得不同基因组完成连接的片段序列混合后进行PCR扩增反应；标准引物见表2。 e.将步骤d所得PCR扩增反应产物与步骤a所设计的捕获探针杂交，杂交反应后通过多次洗脱纯化反应，得到待测片段。 f.将待测片段通过illumina公司的标准方案进行大规模平行测序。 g.将得到的测序结果同标准数据库进行比较，得到诊断结果。 为实现上述技术方案，步骤a所述的捕获探针可以是脱氧核糖核酸(DNA)，也可以是核糖核酸(RNA)组成，但不仅限于DNA和RNA。探针的长度从20bp至100bp不等的与目标互补的片段组成。探针可以是结合在磁珠上的，也可以结合在载玻片上，但不仅限于这些介质。 其中，步骤a所述的捕获探针，包括覆盖以下基因ACTC1、ACTN2、BRAF、CALR3、CASQ2、CSRP3、GLA、HRAS、JPH2、KRAS、LAMP2、LDB3、MAP2K1、 MYBPC3、MYH6、MYH7、MYL2、MYL3、MYLK2、MYOZ2、PRKAG2、RAF1、SOS1、TCAP、TNNC1、TNNI3、TNNT2、TPM1、TTN、TTR、VCL全部外显子片段和两端50bp范围内的序列。这些探针以叠瓦式设计，片段长度为15bp-50bp，最优为22bp；探针之间重叠部分为2-8bp，最优为5bp；覆盖度为1×至10×，最优为3×。 其中，步骤c所述的接头在引物结合区的下游设计标签，标签末端为粘性末端可以和基因组片段结合。接头序列特征如表1所示。 其中，步骤d的引物能够在同样条件下效率均一地扩增含有不同标签接头的片段，扩增出的片段包含作为标签的碱基序列。在步骤d的扩增时，不同样品已经进行了等量的混合。 本专利技术的主要优点在于： 1)本专利技术可以在一次测序反应中同时进行多个不同来源样本全部遗传性的心肌肥厚相关基因的检测；全部序列直接测出，准确率可以达到99.99％。 2)本发本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检验鉴别遗传性心肌肥厚相关基因突变的试剂盒，其特征在于：捕获目的基因探针；一对用于扩增待测片段的通用引物；12对加入不同标签的测序接头序列；缓冲液；dNTP；高保真聚合酶；M？280？Streptavidin(invitrogen公司，112？06D)磁珠。FSA00000585500200011.tif

【技术特征摘要】
1.一种检验鉴别遗传性心肌肥厚相关基因突变的试剂盒，其特征在于：捕
获目的基因探针；一对用于扩增待测片段的通用引物；12对加入不同标签的测
序接头序列；缓冲液；dNTP；高保真聚合酶；M-280 Streptavidin
(invitrogen公司，112-06D)磁珠。
2.根据权利要求1所述的肥厚型心肌病基因检测试剂盒其特征在于；捕获
ACTC1、ACTN2、BRAF、CALR3、CASQ2、CSRP3、GLA、HRAS、JPH2、KRAS、LAMP2、
LDB3、MAP2K1、MYBPC3、MYH6、MYH7、MYL2、MYL3、MYLK2、MYOZ2、PRKAG2、
RAF1、SOS1、TCAP、TNNC1、TNNI3、TNNT2、TPM1、TTN、TTR、VCL全部外
显子片段以及邻近50bp的非编码区的探针。
3.权利要求2所述的探针可以是寡聚核糖核酸(RNA)，也可以是寡聚脱
氧核糖核酸(DNA)，但是不仅限于RNA和DNA，可以包括修饰后的DNA或
者RNA等。
4.根据权利要求2所述的探针可以是结合在磁珠上的，也可以结合在载玻
片上，但不仅限于这些介质。
5.权利要求2所述的探针针对目标区域以叠瓦式设计，探针序列与目标区
域为互补序列。
6.权利要求2所述的探针长度在15-50bp，最优为22bp；探针之间重叠区
域为2-10bp，最优为5bp。
7.根据权利要求1所述的一种检验鉴别遗传性心肌肥厚相关基因突变的试
剂盒其特征在于；12对加入不同标签的接头序列；
8.权利要求5种所述的标签特征是标签序列的位...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯青，
申请(专利权)人：康旭基因技术北京有限公司，
类型：发明
国别省市：