本发明专利技术涉及一种采用实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR技术)检测不同处理下茶树CBF1(CsCBF1)基因相对表达量的方法，属于生物技术领域。包括茶苗处理、所取组织RNA提取、cDNA合成、内参基因选择、荧光定量引物设计、荧光定量PCR反应及CsCBF1基因的相对表达量计算七个主要步骤。其特点是以不同处理下茶树叶片cDNA为模板，甘油醛-3-磷酸-脱氢酶(glyceraldehyde-3-phos-phate dehydrogenase，GAPDH)基因为内参基因，通过荧光定量PCR技术，在mRNA水平上对CsCBF1进行相对定量分析，为研究CsCBF1基因表达调控奠定基础。与现有技术相比，本发明专利技术的检测方法所需时间短，且可以同时分析不同环境处理下CsCBF1基因的表达变化情况，找出能显著诱导CsCBF1基因表达的条件，操作方法简单，所得结果具有重复性好、定量准确等优点。
【技术实现步骤摘要】
—种采用实时定量PCR技术检测茶树CBF1基因表达的方法
本发 明涉及生物
，涉及用于检测CsCBFl基因表达的特异性引物，更具体的说一种采用实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR技术)检测不同处理下，CsCBFl基因相对表达量的方法。主要用于CsCBFl基因表达调控机理的研究。技术背景转录因子CBF(C-repeat_binding factor)广泛存在于各种植物中，在低温逆境信号转导通路中，能够感受上游传递的低温信号，激活冷诱导(和)或脱水诱导基因的表达，从而引起植物体内的多种生理生化变化，并产生一定的抗寒、抗旱和耐盐能力，是植物抗逆过程中一个重要的调节因子。已有研究表明，CBF基因的表达不仅受低温诱导，而且也与机械损伤、干旱、高渗透压等逆境胁迫有密不可分的联系，同时一些与抗冷密切相关的植物激素(如ΑΒΑ、乙烯、油菜素内酯等)对CBF基因的表达也有调控作用。而CsCBFl基因表达与其发挥作用的机理仍不清楚。我们应用实时荧光定量PCR技术，建立检测CsCBFl基因mRNA表达水平的方法，对于阐明CsCBFl基因表达的作用机理具有一定指导作用。在分子生物学领域，很多方法都可以用来进行靶基因的定量研究，这些方法包括Northern/Southern杂交、高效液相色谱(HPLC)、PCR-ELISA、RNA酶保护分析、原位杂交等。但这些方法均存在耗时、费力、敏感性差、需要运用放射性元素或潜在交叉污染的可能性等缺陷。
技术实现思路
本专利技术的目的是公开一种采用实时定量PCR技术进行快速、准确检测茶树CBFl基因表达的方法，从而为阐明CsCBFl基因表达的作用机理奠定基础。为实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案如下:一种采用实时定量PCR技术检测茶树CBFl基因表达的方法，其特征在于包括茶苗处理、所取组织RNA提取、cDNA合成、内参基因选择、荧光定量引物设计及荧光定量PCR反应、CsCBFl基因的相对表达量计算七个主要步骤，具体操作方法如下:(1)实验材料的处理:将茶苗进行4°C、_5°C、干旱、激素处理，分别于不同时间(O、0.5h、lh、2h、4h、8h、16h、24h、48h)进行取样，迅速用液氮收集，_70°C保存，备用；(2)总RNA的提取与纯化:取不同处理下的茶树叶片，利用RNA提取试剂盒，从茶树叶片中提取得到纯化的总RNA ；(3) cDNA第一链的合成:以茶树叶片总RNA为模板合成cDNA第一链，反应体系为20ul ；(4)内参基因的选择:内参须满足:①在研究中样本之间的表达是相似的；②处理因素不会影响其表达与待测基因同时进行相同的扩增等要求。(5)荧光定量引物设计:根据CsCBFl基因序列设计符合荧光定量PCR反应特点的特异引物:yF:5’ -TTTGCTGACTCGGTTTGGAG-3’ ；yR:5，-TCGTCTCAGTCGCAGTTTCA-3，；以及作为内参基因的GAPDH特异上下游引物:GAPDH-F:5，-TTGGCATCGTTGAGGGTCT-3，GAPDH-R:5，-CAGTGGGAACACGGAAAGC-3(6)实时荧光定量PCR:以上述(3)中合成的cDNA第一链为模板，上述(5)中yF、yR、GAPDH-F和GAPDH-R为特异性引物，其中每条引物分别配制成IOu mol/L的工作浓度。进行实时荧光定量PCR扩增反映，每个样品设置3个重复，扩增后所得到3个重复管的Ct值取平均数；(7)不同处理下，CsCBFl基因的相对表达量计算:实时荧光定量PCR完成后，根据Ct值计算每种处理不同时间下的ACt、Δ ACt、2_et值，计算方式如下:ACt = Ct (CsCBFl 基因)_Ct(GAPDH 基因)A ACt = Λ Ct (处理N小时)-Λ Ct (处理O小时)以2_ΔΔΜ数值表示处理时间N小时时，CsCBFl基因相对于GAPDH基因的表达量。本专利技术更加详细的试验方法如下:(I)实验材料的处理:将两年生扦插苗乌牛早移至营养钵中，置于光照培养箱中培养两周，培养条件:白天25°C (16h)，晚上18°C (8h)。然后进行如下处理:A.低温处理:以正常生长条件下(25°C )培养的茶苗为对照，在光照培养箱中对茶苗进行4、-5°C低温处理(无光照)，处理0、0.5h、lh、2h、4h、8h、16h、24h、48h分别取一芽两叶,迅速用液氮收集，-70保存,备用。B.脱水处理:向生长植株的营养钵内一次性浇以15% -30%的PEG600溶液20ml，对照组浇以等量的蒸馏水；处理0、0.5h、lh、2h、4h、8h、16h、24h、48h分别取一芽两叶，迅速用液氮收集，-70保存，备用。C.激素处理:油菜素内酯(BR)处理:在25°C条件下向茶苗喷施0.1-1.5mg/L的BR溶液处理0、0.5h、lh、2h、4h、8h、16h、24h、48h分别取一芽两叶，迅速用液氮收集，-70保存，备用。(2)总RNA的提取与纯化:EASY spin植物RNA快速提取试剂盒，从所取的一芽两叶中提取得到总RNA。(3)cDNA第一链的合成:cDNA第一链的合成采用Fermentas公司的RevertAidFirst Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒,反转录引物使用试剂盒所提供的Oligo (dT) 18引物，以总RNA为模板合成cDNA第一链，反应体系为20ul。(4)内参基因的选择:内参须满足:①在研究中样本之间的表达是相似的；②处理因素不会影响其表达与待测基因同时进行相同的扩增等要求。根据以上原则本实验选择GAPDH为内参基因。(5)荧光定量引物设计:根据CsCBFl基因的全长序列，使用Primer5.0软件设计适用于荧光定量PCR检测的特异性引物，引物序列如下:yF:5’ -TTTGCTGACTCGGTTTGGAG-3J ；yR:5，-TCGTCTCAGTCGCAGTTTCA-3J ；CsCBFl基因的PCR产物预计长度为235bp，琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增后的长度与预计产物长度一致，且为但一条带，说明所设计的引物具有很强的特异性，适合用于实时荧光定量PCR检测；琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示。作为实时荧光定量PCR内参基因GAPDH的引物序列如下:GAPDH-F:5，-TTGGCATCGTTGAGGGTCT-3，GAPDH-R:5，-CAGTGGGAACACGGAAAGC-3GAPDH的PCR产物预计长度为206bp。琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增后的产物长度与预计产物长度一致，且为但一条带，说明所设计的引物具有很强的特异性，适合用于实时荧光定量PCR检测；琼脂糖凝胶电泳结果如图2。(6)实时荧光定量PCR:实时荧光定量PCR采用德国罗氏公司LigntCycler480实时荧光定量PCR仪(配有该公司提供的LigntCycler480荧光定量分析软件)、Fermentas公司的Maxima SYBR Green qPCR Master Mix试剂盒进行。以上述(3)中合成的cDNA第一链为模板，上述(5)中yF、yR、GAPDH-F和GAPDH-R为特异性引物，进行实时荧光定量PCR扩增反映，每个样品设置3个重复，扩增后所得到3个本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种采用实时定量PCR技术检测茶树CBF1基因表达的方法，其特征在于包括茶苗处理、所取组织RNA提取、cDNA合成、内参基因选择、荧光定量引物设计、荧光定量PCR反应及CsCBF1基因的相对表达量计算七个主要步骤，具体操作方法如下： (1)茶苗处理：将茶苗分别置于低温(4℃、‑5℃)、干旱、激素环境下处理不同时间； (2)所取组织RNA提取：取不同处理下的茶树叶片，利用RNA提取试剂盒，从茶树叶片中提取得到纯化的总RNA； (3)cDNA的合成：以茶树叶片总RNA为模板合成cDNA第一链； (4)内参基因选择：根据实时定量PCR反应内参基因选择要求，选择甘油醛‑3‑磷酸‑脱氢酶(glyceraldehyde‑3‑phos‑phate dehydrogenase，GAPDH)基因为内参基因； (5)荧光定量引物设计：根据荧光定量PCR引物设计原则，设计CsCBF1基因、GAPDH基因特异性上下游引物yF、yR和GAPDH‑F、GAPDH‑R； (6)实时荧光定量PCR反应：以上述合成的cDNA第一链为模板，yF、yR和GAPDH‑F、GAPDH‑R为特异性引物，进行实时荧光定量PCR扩增反应。 (7)不同处理下，CsCBF1基因的相对表达量计算：实时荧光定量PCR完成后，根据Ct值计算每种处理不同时间下的ΔCt、ΔΔCt、2‑ΔΔCt值，计算方式如下： ΔCt＝Ct(CsCBF1基因)‑Ct(GAPDH基因) ΔΔCt＝ΔCt(处理N小时)‑ΔCt(处理0小时) 以2‑ΔΔCt数值表示处理时间N小时时，CsCBF1基因相对于GAPDH基因的表达量。...
【技术特征摘要】
1.一种采用实时定量PCR技术检测茶树CBFl基因表达的方法，其特征在于包括茶苗处理、所取组织RNA提取、cDNA合成、内参基因选择、荧光定量引物设计、荧光定量PCR反应及CsCBFl基因的相对表达量计算七个主要步骤，具体操作方法如下: (1)茶苗处理:将茶苗分别置于低温(4°C、_5°C)、干旱、激素环境下处理不同时间； (2)所取组织RNA提取:取不同处理下的茶树叶片，利用RNA提取试剂盒，从茶树叶片中提取得到纯化的总RNA ； (3)cDNA的合成:以茶树叶片总RNA为模板合成cDNA第一链； (4)内参基因选择:根据实时定量PCR反应内参基因选择要求，选择甘油醛-3-磷酸-脱氢!酶(glyceraldehyde-3-phos-phate dehydrogenase, GAPDH)基因为内参基因； (5)荧光定量引物设计:根据荧光定量PCR引物设计原则，设计CsCBFl基因、GAPDH基因特异性上下游引物yF、yR和GAPDH-F、GAPDH-R ； (6)实时荧光定量PCR反应:以上述合成的cDNA第一链为模板，yF、yR和GAPDH-F、GAPDH-R为特异性引物，进行实时荧光定量PCR扩增反应。 (7)不同处理下，CsCBFl基因的相对表达量计算:实时荧光定量PCR完成后，根据Ct值计算每种处理不同时间下的ACt、Δ八以、2_吣值，计算方式如下:Λ Ct = Ct (CsCBFl 基因)-Ct (GAPDH 基因) A ACt = Λ Ct (处理N小时)-Λ Ct (处理O小时) 以2_ΔΔα数值表示处理时间N小时时，CsCBFl基因相对于GAPDH基因的表达量。2.根据权利要求书I所述一...
【专利技术属性】
技术研发人员：丁兆堂，郭秀丽，王玉，贾玉辉，
申请(专利权)人：即墨瑞草园茶业研究院，
类型：发明
国别省市：山东;37
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