基于代谢物及基因表达筛选三七皂苷合成关键基因的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于代谢物及基因表达筛选三七皂苷合成关键基因的方法。具体的是采用高效液相色谱-质谱联用系统对一年生三七不同部位的代谢物含量进行分析，同时利用荧光定量PCR技术对皂苷合成途径关键酶基因表达量进行定量分析，通过典型关联分析构建基因-代谢物相关图，从而对关键基因进行筛选。本发明专利技术为进一步阐明三七中皂苷类物质合成机制提供了重要信息，同时为通过基因调控等手段提高三七皂苷含量提供了重要依据。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及三七中三萜皂苷合成途径关键基因的筛选，具体的是结合一年生三七代谢物含量及三萜皂苷合成途径关键基因的表达量进行典型关联分析(canonicalcorrelationanalysis)，筛选出三七中对皂苷含量贡献度较大的三萜皂苷合成途径关键基因。
技术介绍
三七(Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen)为五加科人参属植物，是我国传统珍贵药材，其主要生理活性成分为三七皂苷。三七的应用在古代主要作为金创要药，用于体内外各种出血及跌打损伤、瘀滞肿痛的治疗。现代药理学研究表明三七总皂苷和部分单体皂苷在血液及心血管系统、系统代谢、免疫及抗炎、抗肿瘤等方面均有较好的生理活性，其多方面的药理作用及保健功能越来越受到人们的重视。目前三七皂苷的主要来源是从栽培三七提取得到的，然而三七为多年生草本植物，生长周期长，且生长条件苛刻、地理分布窄，加之病虫害严重、连作障碍、农药残留等问题，其产量已难以满足快速增长的市场需求。近年来，针对药用植物次生代谢产物的基因调控已成为分子生物学研究的热点，而皂苷类物质是植物次生代谢产物的重要组成部分，其含量和组成主要取决于生物合成关键基因在细胞中的表达水平。在植物细胞中，萜类化合物主要来源于两个前体物质，异戊烯基焦磷酸(IPP)及其异构体二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)。细胞质中的甲羟戊酸(MVA)途径和质体中的2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(MEP)途径都能够产生IPP和DMAPP，且两条途径所产生的IPP可以穿过质体膜互为对方所用。IPP分子和两个DMAPP分子在法尼基焦磷酸合酶(FPS)的作用下生成法尼基焦磷酸(FPP)，两个FPP分子在鲨烯合酶(SQS)的作用下以头-头方式还原偶联生成三萜类物质的前体鲨烯。随后，鲨烯在鲨烯环氧酶(SE)的作用下氧化成2，3-氧化鲨烯，达玛烷二醇合成酶(DS)催化2，3-氧化鲨烯环化为达玛烯二醇。达玛烯二醇是达玛烷型四环三萜皂苷类的骨架，在细胞色素P450单加氧酶及多种糖基转移酶的作用下最终形成不同类型的达玛烷型四环三萜皂苷。目前，植物三萜皂苷合成途径中的一些关键酶基因已在人参属植物中克隆和鉴定，研究证实它们的表达对三萜皂苷合成起着重要调控作用。此外，Niu等人对FPS，SS，SE和DS等基因在四年生三七开花期的表达进行了分析，为进一步阐明皂苷类物质在三七中的合成机制打下了基础。本专利技术以探索三七中三萜皂苷合成关键酶基因表达水平和代谢物含量的关联性为出发点，应用高效液相色谱-质谱联用系统对一年生三七不同部位的代谢物含量进行了分析，同时利用荧光定量PCR技术对其皂苷合成途径关键酶基因表达量进行定量分析，并且通过典型关联分析构建了三七基因-代谢物相关图，对关键基因进行了筛选。在本专利技术之前，尚未出现涉及基于三萜皂苷含量及其合成途径关键基因表达量对三七三萜皂苷合成关键基因进行筛选的公开报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于构建三七生长发育早期皂苷合成关键基因和代谢物含量的关系网络，筛选三七植物中对皂苷合成有重要作用的关键基因。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供的技术方案包括下列步骤：1)分析一年生三七不同部位皂苷类物质代谢轮廓。2)测定皂苷合成途径关键基因在三七不同部位的表达。3)构建基因-代谢物关系网络，筛选三七中皂苷合成关键基因。上述方法中，所述三七不同部位为一年生三七的叶、叶柄及根部。步骤1)所述分析皂苷类物质代谢轮廓是采用高效液相色谱-质谱联用系统对不同部位样品甲醇提取物进行检测，使用内标法通过标准曲线进行定量。分析方法参照Li等人“GlobalanalysisofchemicalconstituentsinShengmaiinjectionusinghighperformanceliquidchromatographycoupledwithtandemmassspectrometry”论文中报道的皂苷定量方法。步骤2)所述三七不同部位皂苷合成途径关键基因的表达是采用荧光定量PCR(RT-Q-PCR)技术进行检测的。具体是分别提取样品RNA，再将RNA反转录合成第一链cDNA，以cDNA为模板，按照Takara公司SYBRPremixExTaqTM说明书中针对96实时荧光定量PCR仪推荐的方法进行设置。上述荧光定量PCR反应中的特异性引物具体序列参见表1。表1RT-Q-PCR中使用的基因引物序列所述实时荧光定量PCR检测的反应条件为：95℃预变性2min，95℃变性10s，57℃退火15s，72℃延伸30s，45个循环。步骤3)中所述基因-代谢物关系网络的构建和生物合成关键基因的筛选是通过典型关联分析将三七皂苷含量与皂苷合成途径关键基因表达量相结合分析得到的。具体的是使用皮尔逊相关系数对皂苷含量及皂苷合成途径关键基因的表达量进行典型相关分析，变量相关系数高于0.5作为筛选关键合成基因的标准。本专利技术基于一年生三七中皂苷类物质代谢及皂苷合成途径关键基因的表达构建了基因-代谢物关系网络，对三七生长初期皂苷合成关键基因进行了筛选，为进一步阐明三七中皂苷类物质合成机制提供了重要信息，同时为通过基因调控等手段提高三七皂苷含量提供了重要依据。附图说明图1为三萜皂苷类物质在生物体内合成途径；图2为一年生三七不同部位皂苷类物质代谢轮廓谱图，其中A是标准品混合溶液，B是一年生三七叶，C是一年生三七根，D是一年生三七叶柄；图3为皂苷在不同部位分布及含量热图；图4为一年生三七不同部位皂苷含量PCA分析图，其中1是一年生三七根，2是一年生三七叶柄，3是一年生三七叶；图5为皂苷合成途径关键基因在一年生三七不同部位中的表达；图6为一年生三七基因-代谢物关系网络。具体实施方式下面对本专利技术的实施例作详细说明，以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本专利技术，但不以任何形式限制本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试剂如无特殊说明，均为市售购买产品。实施例1：代谢轮廓分析。1)材料与方法所用植物材料来自于本实验室栽培三七，三七种子购于云南省文山州，于2013年12月播种于温室，严格按照三七种植标准，保证三七生长环境的阴凉避光及适宜的温湿度。于来年6月对一年生三七植株的叶、叶柄及根部分别取材，样品经液氮速冻后，冷冻保存于-80℃冰箱。2)样品提取将各样品研磨成粉末，经48小时的冷冻干燥后用甲醇对样品进行提取。准确称量50mg样品溶于1.5mL甲醇，涡旋本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于代谢物及基因表达筛选三七皂苷合成关键基因的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)分析三七不同部位三萜皂苷类物质代谢轮廓；(2)分析皂苷合成途径关键基因在三七不同部位的表达谱；(3)构建基因表达和皂苷的代谢相关图，筛选出三七中皂苷合成关键基因。

【技术特征摘要】
1.一种基于代谢物及基因表达筛选三七皂苷合成关键基因的方法，其特征在于包括如
下步骤：
(1)分析三七不同部位三萜皂苷类物质代谢轮廓；
(2)分析皂苷合成途径关键基因在三七不同部位的表达谱；
(3)构建基因表达和皂苷的代谢相关图，筛选出三七中皂苷合成关键基因。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述代谢轮廓采用高效液相色谱-质谱联
用系统进行，所述表达谱采用荧光定量PCR进行，所述相关图采用典型关联分析进行。
3.根据权利要求1所述的方法，所述不同部位包括：叶、叶柄及根。
4.根据权利要求1所述的方法，所述关键基因包括：法尼基焦磷酸合酶(FPS)、鲨烯合酶
(SQS)、鲨烯环氧酶(SE)、达玛烷二醇合成酶(DS)...

【专利技术属性】
技术研发人员：齐炼文，陆续，王宁，李萍，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32