一种黄牛SPAG17基因插入/缺失的检测方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种黄牛SPAG17基因插入/缺失的检测方法及其应用。以包含SPAG17基因的待测全基因组DNA为模板，以参照牛全基因组设计的引物对P1为引物，通过PCR技术扩增SPAG17基因，再进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果鉴定SPAG17基因在AC_000160:g146755-146756insTCCTGACT位点存在不同的基因型。结果发现，SPAG17基因8-bp插入/缺失的不同类型与夏南牛体高和体斜长等生长发育性状之间存在显著相关，提示SPAG17基因8-bp插入/缺失的不同类型可作为提高夏南牛生长发育性状的DNA标记。故本发明专利技术将有利于快速建立生长发育性状优良的黄牛遗传资源群体。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于现代生物技术与家畜育种领域，涉及基因插入/缺失(indel)的检测，特别涉及一种检测夏南牛SPAG17基因8-bp插入/缺失(indel)的方法。
技术介绍
动物育种技术主要包括以表型和表型值为基础的常规育种技术和以DNA多态为基础的分子育种技术。作为分子育种技术体系的重要组成部分，分子标记辅助选择(marker-assistedselection，MAS)育种技术首先检测重要基因的DNA多态性，然后分析DNA多态与遗传性状之间的相关性，最后再根据与遗传性状显著相关的DNA标记进行性状选择。作为现代分子生物学技术发展过程中孕育而生的新技术，MAS育种技术可以在DNA水平上快速准确地分析个体的遗传组成，该方法通过有性杂交将目的基因转移到需要改良的亲本中，将目标基因型的鉴定与传统育种相结合，从而实现对基因型的直接选择，提高育种目标的定向性。该方法在克服表型鉴定的困难、早期选择、进行无损害的性状评价和选择及提高回交育种效率等方面具有优越性。在MAS育种技术体系中，寻找重要功能基因、筛查重要基因遗传变异位点，并分析重要功能基因遗传变异位点与生长性能的相关性，是分子标记辅助选择技术应用的前提和关键。作为分子遗传标记的重要方式之一，插入/缺失(indel)是一种新型分子标记。indel是指DNA序列上核苷酸片段的插入或缺失而引起DNA序列的改变，造成包括人类在内的物种之间染色体基因组的多样性。随着对基因组研究的逐渐深入，基因组上的一种亚显微水平的结构变异--拷贝数变异(copynumbervariations,CNVs)被广泛报道，现已成为“基因组变异”到“表型变化”的另一研究热点。由于CNV涉及到更多的基因序列，甚至包含整个功能基因，因此，能够通过基因剂量效应的改变，进而影响该基因控制的表型。在近年的《GenomeResearch》杂志上，Bickhart等人(2012)利用全基因组测序技术，检测到了许多个与牛生长、肉质相关的QTLs位于CNVs区域内，表明影响个体表型差异的CNVs广泛存在于基因组中。indel是指基因组中片段长度在1-50bp之间的插入或缺失，可能包括微小CNV，利用indel分析个体基因组可以更好地解释个体的表型差异，因此从DNA水平上对小片段核苷酸的差异进行indel检测在动物分子育种的MAS体系中具有重要意义。在基因组中，CNV通常发生的区域含有大片段序列重复(Homologousrepeats)或SD序列(Segmentalduplications)。SD序列是指由于基因组重排产生的长度大于1kb串联重复的DNA片段，且序列之间具有90％以上的同源性(Redonetal2006)。CNV形成的变异机制主要有：非等位同源重组NAHR(Non-allelichomologousrecombination)、非同源末端连接NHEJ(Non-homologousendjoining)、复制滑动(Replicationslippage)和反转录座(Retrotransposition)。为探索从基因组CNVs到表型变化的作用机理，科研人员通过大量的假设和实验验证，认为CNVs影响表型的作用机制主要有以下几个方面：1)小片段的重复、缺失/插入，改变单个基因或与其临近的几个基因，直接导致基因剂量的改变、使相关的蛋白质的表达量的减少或增加，进而引起表型的变化。2)DNA片段的倒位，功能基因倒位至无活性异染色体区域，使基因不表达或表达量极少，从而导致表型的变化。3)调控基因转录调控因子，间接影响基因表达量。另外，有些CNVs具有一定的干扰效应，但涉及到的区域通长不会引起重要的功能基因改变。正常个体的一个基因发生拷贝数变异不一定会导致表型的相关改变，因为很多表型都是多基因控制的数量性状，该基因发生CNVs所产生的功能缺失会被其他功能类似的基因补偿，从而缓冲了这种不平衡作用。所以，在群体遗传研究中，微小CNV(插入/缺失)作为遗传标记在群体遗传和生物进化的研究中也具有重要意义。因此，indel在育种的研究中具重要意义，倍受动物育种专家的青睐。插入/缺失(indel)是DNA或蛋白质序列水平上发生频率仅次于残基替换的进化改变，indel多态性是基因组中一种特殊类型的二等位基因遗传标记，表现为基因组中插入或缺失了不同大小的小片段DNA。indel大致分成以下5大类：(1)单碱基对的插入/缺失；(2)单一碱基的插入/缺失；(3)重复单元为2～15碱基的多碱基对插入/缺失；(4)转座子插入/缺失；(5)任意DNA序列的插入/缺失多态性。随着比较基因组学的深入研究，indel为理论研究和遗传育种应用研究提供了大量的生物信息，其作为新一代的遗传学鉴定标记，兼具SNP的优点，与SNP相比，均是源于单突变事件，其突变频率较低，约为10-8，相对比较稳定。在结构上属于二等位基因多态性，等位基因都固定且已知，能够通过很小的扩增子进行扩增(<50bp)，提高了扩增高度降解DNA的成功率。作为一种重要的遗传标记，indel的研究最早聚焦在分子生物学及生物医学领域。遍布于整个基因组的indel频率仅次于SNP，位居第二，其中约三分之一位于已知的基因区域内，还有一些位于决定基因功能的关键性区域，如启动子区和外显子区。分子生物学家最早将其用于基因表型相关的研究，希望通过将人类性状、疾病症状或是易感性进行联系，从而达到基因诊断和治疗的目的。2005年，Bhangale等报道了一种能够从目的基因中全面识别indel变异的方法，并应用该方法从330个备选基因中找到2393个indel变异位点，得出人类基因组中插入/缺失态出现的频率高于插入多态性的结论，同时提出，indel和SNP的形成机制可能不同，但其进化史是相似的。然而相关的后续报道并不是很多，甚至在近几年有递减的趋势。随着经济发展和人们生活水平的不断提高，社会对黄牛产品的需求不断加强，但由于近年来牛肉、牛奶等产品严重短缺，所以黄牛育种专家期望更早、更好、更快地获得黄牛产品的优良品种。在高产、优质和高效的黄牛育种目标上，黄牛育种专家一直关注生长发育性状，但仅靠传统育种手段是不行的，还需要依靠分子育种技术。即首先在DNA水平上筛查和检测与黄牛生长发育性状密切相关的DNA标记，然后进行基因多态性的检测，最后是进行基因多态性与生长发育性状的关联分析，从而实现MAS和实现早期诊断选择。精子相关抗原17(Sperm-associatedantigen17,SPAG17)基因，又叫做鞭毛中央对相关(Flagellarcentralpair-associated，PF6)基因。在人上SPAG17基因还通过影响骨骼的生长从而影响人的身高。人类的身高是一种可遗传的典型多基因性状，是许多生长发育过程的结果。大多数与身高相关的基因在骨骼发展中发挥作用。SPAG17基因的单核苷酸多态性与人类身高有关。然而,目前尚不清楚这个基因如何影响线性增长。MariaEugeniaTeves等(2015)表明，SPAG17基因有针对性的突变会导致骨骼畸形。后肢在突变体长度明显短于本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种黄牛SPAG17基因插入/缺失的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：以待测夏南牛全基因组DNA为模板，以引物对P1为引物，通过PCR扩增夏南牛SPAG17基因片段，该片段包含夏南牛SPAG17基因8‑bp插入/缺失多态性位点；再对PCR扩增得到的片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定夏南牛SPAG17基因8‑bp插入/缺失多态性位点的插入/缺失多态性；所述的引物对P1为：上游引物：5’‑ACATGGGAGAAATACCCG‑3’；下游引物：5’‑GTCTGAAGATGGCAAACG‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种黄牛SPAG17基因插入/缺失的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：以待
测夏南牛全基因组DNA为模板，以引物对P1为引物，通过PCR扩增夏南牛SPAG17基
因片段，该片段包含夏南牛SPAG17基因8-bp插入/缺失多态性位点；再对PCR扩增得到
的片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定夏南牛SPAG17基因8-bp插
入/缺失多态性位点的插入/缺失多态性；所述的引物对P1为：
上游引物：5’-ACATGGGAGAAATACCCG-3’；
下游引物：5’-GTCTGAAGATGGCAAACG-3’。
2.根据权利要求1所述一种黄牛SPAG17基因插入/缺失的检测方法，其特征在于：
所述PCR的扩增反应程序为：
1)94℃预变性5min，然后进入步骤2)；
2)94℃变性30s，复性30s，72℃延伸20s；共18个循环；第一个循环中复性温
度为68℃，剩余每个循环中复性温度较上一个循环降低1℃，然后进入步骤3)；
3)94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸20s；共24个循环，然后进入步骤
4)；
4)...

【专利技术属性】
技术研发人员：蓝贤勇，金云云，陈宏，雷初朝，祁兴磊，林凤鹏，祁兴山，屈卫东，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61