本发明专利技术公开了一种检测U?BCR融合基因mRNA表达量的试剂盒，属于生物技术领域。所述试剂盒包括检测用引物、荧光探针、cDNA第一链合成试剂、荧光定量PCR混合液、阴性对照和阳性对照，所述检测用引物、荧光探针包括U?BCR融合基因引物、内参基因ABL引物及Taqman荧光探针。U?BCR融合基因主要见于Ph+的慢性中性粒细胞白血病，该基因编码具有较高的酪氨酸蛋白激酶活性，使细胞在不依赖细胞因子的情况下发生过度增殖、分化，并且使正常的细胞凋亡受到抑制。采用荧光定量PCR检测U?BCR融合基因mRNA水平，其检测结果的特异性和敏感度均显著提高。所述试剂盒为慢性中性粒细胞白血病的诊断及预测预后以及化疗方案的确定提供了一种全新的快速简便的基因诊断技术。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
的荧光定量PCR技术，特别涉及一种检测U BCR融合基因mRNA表达量的试剂盒。
技术介绍
慢性粒细胞白血病(Chronic Myelocytic Leukemia, CML)是一种多能干细胞增殖异常引起的恶性肿瘤，对该疾病的真正认识源于费城染色体(Philadelphia Chromosome,Ph)的发现，数据显示90%以上的CML病例中都有Ph的存在，该染色体是由9号染色体和22号染色体相互易位形成，即t (9,22) (q34:qll)，易位使9号染色体长臂末端(9q34)的c-abl原癌基因在第2位外显子的5’端发生断裂，然后与22号染色体长臂末端(22qll)的c-BCR融合基因的3’端发生融合形成bcr/abl融合基因，其中部分CML患者BCR融合基因 中的断裂点融合成转录成el9a2，称之为UBCR融合基因，主要见于Ph +的慢性中性粒细胞白血病。该融合基因编码一个嵌合体蛋白质P230，它具有较高的酪氨酸蛋白激酶活性，使一系列底物蛋白磷酸化，由此激活多条信号传导途径，使细胞在不依赖细胞因子的情况下发生过度增殖和分化，并且使正常的细胞凋亡受到抑制。放疗与二甲磺酸丁酯等药物用于CML的早期治疗，尽管它们可以改善症状，提高患者生命质量，但不能延长患者生命。后来的轻基脲(Hydroxycarbamide,HU)与造血干细胞移植(Hematopoietic stem cell transplantation, HSCT)以及在少数患者中使用的重组体干扰素(recombinant interferon alpha, rIFNα )为延长患者生命起到了很大的作用。一种蛋白激酶抑制剂伊马替尼(Tyrosine Kinase inhibitor, TKI)被证明具有高且相对特异性的生物活性，因此迅速应用于临床，它是通过抑制过度激活的酪氨酸及酶活性来控制白血病细胞生长，诱导其凋亡的一种药物。它对大多数bcr/abl融合基因阳性的CML患者有效。研究表明，CML患者经伊马替尼治疗达到细胞学完全缓解后，随着治疗时间的延长，bcr/abl融合基因定量的结果呈逐渐下降的趋势，最终甚至完全检测不到。然而，bcr/abl融合基因激酶结构突变、bcr/abl融合基因扩增和过度表达会引起患者对伊马替尼耐药。而且相关研究也提到，CML患者处于不同病理期时，骨髓增殖情况也不同，白血病细胞的增殖也存在差异，处于CML慢性期和加速期的患者bcr/abl融合基因表达量显著低于急变期。因此，通过检测U BCR融合基因水平，可以指导临床针对患者个体水平合理选择药物剂量或是否联合其他药物治疗，同时，也可以为诊断CML的白血病细胞增殖情况和病理分期提供依据。较之使用常规定性PCR方法对U BCR融合基因进行半定量检测或免疫学方法对bcr/abl蛋白进行定量检测,突光定量PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链式反应)技术也具有较高的灵敏度和特异度。实时荧光定量PCR技术实现了 PCR从定性到真正意义的定量的飞跃，为人类疾病基因的定量检测提供了一个行之有效的检测工具，与普通PCR相比具有特异性增强、灵敏度提高和检测快速并降低了污染等特点，但目前尚未有荧光定量PCR方法检测慢性粒细胞白血病中U BCR基因的相关报道。
技术实现思路
为了解决现有技术的问题，本专利技术实施例提供了一种检测U BCR融合基因mRNA表达量的试剂盒。所述技术方案如下本专利技术实施例提供的一种检测U BCR融合基因mRNA表达量的试剂盒，包括检测用引物、荧光探针、cDNA第一链合成试剂、荧光定量PCR混合液、阴性对照和阳性对照，所述检测用引物、荧光探针包括U BCR融合基因引物、内参基因ABL引物及Taqman荧光探针，其中U BCR融合基因上游引物序列如序列表中SEQ ID NO: I所示；U BCR融合基因下游引物序列如序列表中SEQ ID N0:2所示；U BCR融合基因Taqman荧光探针如序列表中SEQ ID NO: 3所示； ABL基因上游引物序列如序列表中SEQ ID N0:4所不；ABL基因下游引物序列如序列表中SEQ ID N0:5所不；ABL基因Taqman突光探针如序列表中SEQ ID NO:6所示；所述cDNA第一链合成试剂含有MgCl2、逆转录酶缓冲液、dNTPs、RNA酶抑制剂、Oligo (dT) 15、AMV逆转录酶和无RNase去离子水；所述荧光定量PCR混合液含有PCR预混合液、Mg2+、dNTPs、dUTP、Taq 酶、UNG 酶和无 RNase 去离子水。进一步地所述试剂盒还包括内部阳性控制序列、内部阳性控制序列的引物和Taqman荧光探针，其中内部阳性控制序列如序列表中SEQ ID N0:7所示；内部阳性控制序列的上游引物如序列表中SEQ ID N0:8所示；内部阳性控制序列的下游引物如序列表中SEQID NO: 9所示；内部阳性控制序列的Taqman突光探针如序列表中SEQ ID NO: 10所示。进一步地，所述U BCR融合基因的Taqman荧光探针和ABL基因的Taqman荧光探针的5’端连接有荧光报告基团FAM，3’端均连接有荧光淬灭基团TAMRA ;所述内部阳性控制序列的Taqman荧光探针的5’端连接有荧光报告基团TET，3’端连接有荧光淬灭基团TAMRA。进一步地，所述内参基因ABL的核酸序列如序列表中SEQ ID NO: 11所示。进一步地，所述cDNA第一链合成试剂为25mmol/L MgCl2 4 μ L, IOX逆转录酶缓冲液 2 μ L，IOmmoI/L dNTP 2 μ L, RNA 酶抑制剂 O. 5 μ L, Oligo (dT) 15 O. 5 μ g, AMV 逆转录酶I. 5U和无RNase去离子水,总体积11 μ L。进一步地，所述阴性对照为去离子水；所述阳性对照为含有U BCR融合基因的总RNA样品。进一步地，所述荧光定量PCR的混合液(以反应体系终浓度表示)为·ΛΧ的PCR预混合液(原液为 2XPCR Premix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、。· 2-0. 4mM 的 dNTPs,O. 3-0. 6mM 的dUTP、0. 2U/ μ L 的 Taq 酶和 O. 01-0. 05U/ μ L 的 UNG 酶以及无 RNase 去离子水。本专利技术实施例提供的技术方案带来的有益效果是本专利技术实施例提供的一种检测U BCR融合基因mRNA表达量的试剂盒，应用荧光定量PCR技术检测U BCR融合基因的mRNA水平，可以指导临床针对患者个体水平合理选择药物剂量或是否联合其他药物治疗，同时，也可以为诊断CML的白血病细胞增殖情况和病理分期提供依据。较之使用免疫学方法对bcr/abl蛋白进行定量，其还具有以下的优点(I)敏感性高可重复敏感度为O. 01%,即10000个细胞中有一个含U BCR融合基因就可以被检测出。(2)特异性强使用特异性探针对定量分子进行识别，具有很高的准确性。同时，靶序列由引物和探针双重控制，特异性好且假阳性低。(3)简便安全操作简单、安全、自动化程度高而且防污染。扩增和检测可以在同一管内检测，不需要开盖，不易污染，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测U？BCR融合基因mRNA表达量的试剂盒，包括检测用引物、荧光探针、cDNA第一链合成试剂、荧光定量PCR混合液、阴性对照和阳性对照，其特征在于，所述检测用引物、荧光探针包括UBCR融合基因引物、内参基因ABL引物及Taqman荧光探针，其中：U？BCR融合基因上游引物序列如序列表中SEQ？ID？NO:1所示；U？BCR融合基因下游引物序列如序列表中SEQ？ID？NO:2所示；U？BCR融合基因Taqman荧光探针如序列表中SEQ？ID？NO:3所示；ABL基因上游引物序列如序列表中SEQ？ID？NO:4所示；ABL基因下游引物序列如序列表中SEQ？ID？NO:5所示；ABL基因Taqman荧光探针如序列表中SEQ？ID？NO:6所示；所述cDNA第一链合成试剂含有MgCl2、逆转录酶缓冲液、dNTPs、RNA酶抑制剂、Oligo(dT)15、AMV逆转录酶和无RNase去离子水；所述荧光定量PCR混合液含有PCR预混合液、Mg2+、dNTPs、dUTP、Taq酶、UNG酶和无RNase去离子水。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：童永清，李艳，
申请(专利权)人：童永清，李艳，
类型：发明
国别省市：
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