超高处理量光学-纳米孔DNA读出平台制造技术

本文描述了分析聚合物分子的方法。这些方法用于以单分子灵敏度高处理量读出DNA和RNA分子。本发明专利技术的方法包括：(1)DNA(或RNA)双链的电控制的解链,和(2)使用一种或多种分子信号检测，读出分子的身份(或密码)。本发明专利技术还提供了一种超高处理量光学-纳米孔DNA读出平台。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术提供了分析聚合物分子的系统。更具体地，本专利技术涉及单链多核苷酸分子测序。背景自从Watson和Crick于1953年阐明DNA分子的结构以来,遗传研究人员已经试图发现快速且有效的对单个DNA分子测序的方法。在1975至1977年间，Sanger/Barrell和Maxam/Gilbert开发了 2种进行DNA测序的新方法,它们代表着测序技术的重大突破。今天广泛使用的所有方法都是基于Sanger/Barrell方法,近23年来DNA测序的发展是对该方法的或多或少的改进。多核苷酸是包含以线性方式结合到一起的核苷酸的重复单元的聚合分子。多核苷酸的实例是脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。DNA聚合物由4种称作腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)的不同核苷酸碱基串组成。这些碱基在特定基因中的特定顺序或“序列”，决定着基因编码的蛋白的结构。而且，基因周围的喊基序列典型地含有关于在何种细胞类型中以何种频率广生特定蛋白等的 目息。了解基因中和周围的DNA序列，会提供关于基因的结构和功能、它编码的蛋白、它与其它基因和蛋白的关系的有价值的信息。RNA在结构上和化学上与DNA有关，但是，RNA的糖组分是核糖(与DNA不同，后者是脱氧核糖)，且碱基胸腺嘧啶被尿嘧啶取代。本领域的技术人员会认识到，特定的DNA序列和某些疾病状态之间存在直接的关系。该事实已经促使许多制药公司大量地投入到基因组研究领域，希望发现这些疾病潜在的遗传性质。序列信息重要的另一个原因是，期望的基于他或她的遗传学序列确定个体对特定疾病的易感性的能力。遗传诊断学领域致力于鉴别其在基因组中的存在与特定障碍或特征的发生有关的核苷酸序列元件。可得到的关于在人群中观察到的基因组序列元件的信息越多，该领域变得越有力。而且，越迅速地测试关于序列元件在总体人群中的流行率和外显率的信息，以及这样的元件在特定个体的基因组中的存在，分析变得越有效。序列信息有价值的另一个原因是，许多制药公司试图开发针对个体的遗传学特征定制的药物。目的是提供靶向的有效药物，可能使用与施用该药物的特定个体的遗传特性相适应的降低的剂量水平。大多数目前可得到的核苷酸测序技术如下确定给定多核苷酸链的核苷酸序列建立不同长度的互补链的集合，使得该集合包括在目标序列的每个碱基处终止、且大小范围从仅几个核苷酸至目标分子全长的分子。然后，通过分析截短的互补链，并确定4种DNA核·苷酸中的每一种终止了哪些链，确定目标分子的序列。通过按长度顺序排列截短的分子，构建"梯子"，并读出每个梯级的末端残基，以提供目标多核苷酸序列的互补物。目前可得到的DNA测序系统非常有力。但是，它们受到它们的速度、它们的复杂性和它们的成本的限制。目前可得到的自动测序仪的速度受到机器不能一次分析序列中超过数百(典型地，约600)核苷酸的限制。考虑到将小于1000碱基长度的链正确地拼接到一起所需的重叠，标准的测序过程必须进行多达7000万次，以便确定人基因组序列(Technology Review 102(2) :64-68 1999 Mar/Apr ;在本文中引作参考)。甚至以每天 I亿碱基的理论速度，将人基因组测序一次也需要至少一年。利用这些技术，大规模测序不会变成临床工具。为了使遗传诊断学可在临床环境中实践，测序速度必须提高至少3至5个数量级。现有的测序技术的复杂性源自扩增和修饰待测序的遗传分子的需要。化学地或酶促地进行该修饰，通过许多加热和冷却的循环实现扩增。扩增和修饰待测序的DNA的更为流行的方式之一是，使用聚合酶链式反应(PCR)。PCR包含变性、退火和使用DNA聚合酶延伸的连续循环，并导致DNA的起始链的指数扩增。与循环的每个部分有关的时间长度，取决于液体体积和待扩增的DNA的长度。典型的时间是下述量级变性步骤10-30秒，退火步骤5-30秒，和延伸步骤1-4分钟。该循环通常进行15至30次。因此，根据待扩增的DNA的长 度，常见的PCR时间是I至3小时。限制变性、退火和标记的根本物理过程是需要的可检测链的数目，进行该过程所需的时间，和酶的持续合成能力。这整个过程耗时，且需要遵循有关操作。目前，需要更有效的对多核苷酸测序的方法。本专利技术提供了这样的方法。简述本专利技术指向分析聚合物分子的方法。这些方法用于以单分子灵敏度高处理量读出DNA和RNA分子。本专利技术的方法包括=(I)DNA(或RNA)双链的电控制的解链，⑵使用一种或多种分子信号检测，读出分子的身份(或密码)，和(3)借助于核酸和杂交探针之间的分子相互作用，有控制地减缓纳米孔穿线(threading)过程(例如，强相互作用探针会导致转移(translocation)速度的进一步降低)。本专利技术指向一种测序方法，其包含目标多核苷酸(例如DNA)向设计的多核苷酸聚合物(或简称"设计聚合物")的转化。该设计聚合物由二进制码编码，后者由检测器读出，从而提供反映原始目标多核苷酸的序列信息。在本专利技术的一个实施方案中，将目标双链多核苷酸转化成设计聚合物。在一个方面，加工目标的单链。转化包含用2个设计单体替换目标多核苷酸的每个核苷酸碱基，从而将碱基表达为二进制码。例如，碱基腺嘌呤可以表示为0+0，碱基胞嘧啶可以表示为0+1，碱基鸟嘌呤可以表示为1+0，且碱基胸腺嘧啶可以表示为1+1。在一个特定的方面，每个设计单体是双链多核苷酸序列。每个设计单体代表着"O"或"I"。因此，对于目标多核苷酸的每一个碱基，存在2个对应的双链设计单体。在一个方面，以能反映目标多核苷酸的核苷酸序列的方式连接设计单体，从而形成设计聚合物。在一个方面，将双链设计聚合物转化成单链分子。单链设计聚合物与适当的分子信标杂交，其中每个分子信标包含一个或多个信号分子和一个或多个淬灭分子。在本专利技术的一个方面，设计聚合物仅包含2组设计单体(I) 一组设计单体编码"O"，且(2)另一组设计单体编码"I"。在本专利技术的一个特定方面，仅使用2组分子信标。一组分子信标与代表"O"的设计单体杂交，而第二组分子信标与代表"I"的设计单体杂交。在一个方面，两组分子信标包含独特的信号分子，使得与"O"设计单体杂交的分子信标具有不同于与"I"设计单体杂交的分子信标的信号分子。分子信标与设计聚合物的单个设计单体的杂交，形成信标-设计聚合物复合物(或简称"BDP复合物")。 在本专利技术的一个方面，分子信标包含合适的荧光团作为信号分子。在另一个方面，分子信标不仅包含突光团，还包含淬灭剂。在一个特定的方面，突光团位于信标的5'端,而淬灭剂位于它的V端。本专利技术的方法采用双螺旋核酸的电驱动解链。通过使用电驱动的纳米孔解链方法，可以维持对解链时间的控制，允许使用例如自淬灭的荧光探针，例如广泛使用的分子信标。有利地，可以使用不同的测量方案，其中淬灭荧光探针，直到通过解链事件设定的它们的读出时刻。本专利技术的一个实施方案指向纳米孔系统。在一个方面，纳米孔包含α -溶血素。可以使用本专利技术的纳米孔，得到多核苷酸的序列信息。可以将BDP复合物引入本专利技术的纳米孔。在一个方面，存在引入本专利技术的纳米孔的(BDP复合物的)设计聚合物的3'突出。该3'突出序列可以穿过纳米孔，直到BDP复合物的双链部分与入口孔对合。纳米孔的尺寸是这样的，仅仅单链多核本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种组合物，包含：可杂交探针聚合物，包括以对应于目标多核苷酸的核苷酸序列的顺序连接在一起的多个可杂交探针单体，其中所述可杂交探针聚合物中的一个或多个可杂交探针单体与所述目标多核苷酸的一个或多个预订的核苷酸碱基相对应；多个可淬灭荧光探针，每个可淬灭荧光探针包含核苷酸序列、荧光团和淬灭剂，其中：每个可淬灭荧光探针与可杂交探针聚合物中的一个可杂交探针单体杂交；并且除了末端可淬灭荧光探针之一的荧光团外，每个荧光团被临近可淬灭荧光探针的淬灭剂所淬灭。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：A·梅勒，J·麦瑟，J·S·埃德，
申请(专利权)人：哈佛学院院长等，
类型：发明
国别省市：