本发明专利技术涉及hWAPL荧光探针的制备方法，还涉及利用这些探针制备的荧光原位杂交检测试剂盒。利用本发明专利技术提供的hWAPL荧光探针结合杂交缓冲液、未标记的竞争性DNA及DAPI复染剂可以制备一种检测试剂盒，实现hWAPL基因检测，有助于子宫颈癌的早期筛查和治疗方案选择，从而降低死亡率，减少复发风险，达到优化诊疗效果的目的。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及hWAPL荧光探针的制备方法，还涉及利用这些探针制备的荧光原位杂交检测试剂盒，本专利技术的hWAPL荧光探针及相应的试剂盒可用于子宫颈癌的早期筛查和治疗方案选择。
技术介绍
子宫颈癌(cervical carcinoma)是女性常见恶性肿瘤之一,是指发生在子宫阴道部及宫颈管的恶性肿瘤。在全球范围内，每年约有20多万女性死于宫颈癌。在发展中国家，宫颈癌则属于常见多发的妇科肿瘤，排行榜首。我国每年新发病例有13. 5万，死亡率占总癌症死亡率的第一位。近年来,全国宫颈癌病例呈现年轻化的趋势。女性患宫颈癌以36岁 50岁最为集中，占总患病人数的57%左右。在活跃的化生过程中，加上一些外来致癌物质的刺激，可使活跃的未成熟细胞或增生的鳞状上皮细胞向不典型增生方向发展，此时的上皮细胞不同于正常细胞，但不足以诊断为癌，称为癌前期病变。虽然并非所有的不典型增生均会发展为子宫颈癌，但据统计，如不给予治疗，有10% 15%的轻、中度和75%的重度不典型增生将会转变为浸润癌。对于宫颈癌的转移，可向邻近组织和器官直接蔓延，也可通过淋巴管转移至宫颈旁、髂内、髂夕卜、腹股沟淋巴结，晚期甚至可转移到锁骨上及全身其他淋巴结。临床追踪观察显示，从一般的宫颈癌前病变发展为宫颈癌大约需要10年时间，而当宫颈癌的症状出现三个月后的就诊者有2/3已为癌症晚期。目前治疗方案以手术和放射治疗为主，但中晚期患者治愈率很低。及时发现和治疗宫颈癌前病变，将有效终止其向宫颈癌的发展，大大提高宫颈癌的治愈率人半翼基因hWAPL (human wings apart-like, hwapl)是果妮半翼基因(wingsapart-like, wap I)的同源基因，与wapl具相似功能,编码蛋白具调节异染色质结构的功能，通过与黏连蛋白结合，调节姐妹染色单体的分离。近年来的研究发现，hWAPL是仅在宫颈癌组织中特异高表达的基因，具有癌基因的特性，与宫颈癌的发展有关。其相应的RNAi能明显抑制细胞hWAPL的表达并促进细胞凋亡，是宫颈癌基因治疗的一个潜在靶点。目前试验室检测方法常见的有免疫组化、Northern印迹技术和荧光定量PCR方法(FQ-PCR)。2004年，Oikawa等利用Northern印迹技术对宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌等及其相应正常组织中的hWAPL基因mRNA表达水平进行检测，发现宫颈癌中该基因的mRNA表达升高十分明显。2007年，鲁笑钦等人研究了 hWAPL基因在正常宫颈组织、宫颈癌以及胃、肝、膀胱、食道、子宫内膜、肾、直肠、肺等8种癌组织中的表达情况，免疫组化PV-9000方法结果显示，.正常宫颈和宫颈癌组织中hWAPL基因阳性表达率分别为3. 70%、97.87%。hWAPL基因在胃癌、肝癌、子宫内膜癌、肾癌、直肠癌、肺癌中呈阴性表达，在膀胱癌和食管癌中仅有部分样本呈弱阳性表达，认为hWAPL 基因是一种宫颈癌特异性高表达基因。2011年，Guangtao Xu等人利用IHC方法，以CIN I-III和宫颈鳞癌为样本研究了 hWAPL在宫颈疾病诊断中的临床应用价值，认为hWAPL有望成为诊断低阶CIN的标志物。2012年，张文虹等人利用荧光定量聚合酶链反应技术(FQ-PCR)检测慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤样变(CIN)和宫颈癌共100例患者hWAPL基因mRNA，结果宫颈癌组hWAPL基因mRNA表达显著高于慢性宫颈炎组和CIN I III组(P < O. 05)，慢性宫颈炎组与CIN I III组比较，差异无统计学意义(P > O. 05)。认为hWAPL mRNA表达与宫颈癌变直接相关，特异性高，有助于宫颈癌早期诊断。综上，hWAPL因其在宫颈癌中的特异表达特征，及其表达抑制所导致的宫颈癌癌细胞的死亡，有望作为肿瘤早期筛查和靶向治疗的新靶标。但该基因的检测方法目前仅停留在试验室阶段，市场无灵敏度高、特异性好的检测试剂。荧光原位杂交技术基于碱基互补原则，用已知序列标记DNA探针与载玻片上的待测DNA/RNA互补杂交，在荧光显微镜下检测杂交信号判断结果。FISH技术将细胞遗传学和分子生物学改变联系起来，让微小的基因改变显现于肉眼之下，拓展了细胞遗传学检测的范围，显著提高了其识别异常染色体的能力。目前已被广泛应用于肿瘤研究中的基因扩增、易位重排及缺失等检测。本专利技术利用荧光原位杂交技术，以hWAPL基因区段为靶标，设计并制备荧光探针。利用探针实现对hWAPL基因状态的检测，有助于子宫颈癌的早期筛查和治疗方案制定，通过早防早治，达到子宫颈癌可预防可治愈的目的。本专利技术提供了一种子宫颈癌分子标志物hWAPL探针的制备方法，并在此基础上利用探针自主研制了 hWAPL基因检测试剂盒，填补了国内该检测领域的空白，具有十分重大的意义。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供hWAPL基因探针(GSP hffAPL)和作为内控的用于10号染色体鉴别的10号染色体着丝粒探针(CSP10)的制备方法。根据本专利技术一个优选的实施方案，GSP hffAPL的制备步骤包括(I)克隆筛选通过NCBI Mapview数据库检索所有含有hWAPL(10q23)基因的克隆，并对这些克隆进行筛选，选择最优的克隆。(2)克隆培养和鉴定按照筛选确定的克隆编号购买相应的克隆(InvitrogenRPCIlL C)，取100 μ I克隆菌液加入至500ml的TB培养液(氯霉素抗性)中，37°C摇床中摇菌培养8 12小时；针对hWAPL基因探针使用相应的STS引物进行PCR扩增，并通过2%琼脂糖凝胶电泳对扩增产物片段进行分析，从而完成待选克隆的鉴定。(3)基因探针制备对鉴定阳性的菌液，进行质粒DNA的提取；通过OD值的测定对质粒DNA进行定量；然后，对质粒DNA进行荧光标记；对标记产物进行纯化；获得探针，避光、-20±5°C储存。(4)基因探针验证使用人类正常分裂中期淋巴细胞滴片进行探针验证。根据本专利技术一个优选的实施方案，CSPlO的制备步骤包括 (I)片段分析通过NCBI Mapview数据库检索重复区域序列，进行重复性分析。(2)引物设计针对重复片段，利用Primer Premier5. O设计引物对。(3)克隆、培养和鉴定以人基因组DNA为模板，利用上述引物对进行PCR反应。通过电泳进行鉴定；将目的产物进行克隆、培养，同样使用上述引物对进行PCR扩增，并通过2%琼脂糖凝胶电泳对扩增产物片段进行分析，从而完成待选克隆的鉴定。(4)探针制备对鉴定阳性的菌液，进行质粒DNA的提取；通过OD值的测定对质粒DNA进行定量；然后，对质粒DNA进行荧光标记；对标记产物进行纯化；获得探针，避光、-20±5°C储存。(5)探针验证使用人类正常分裂中期淋巴细胞滴片进行探针验证。根据本专利技术一个优选的实施方案，克隆筛选步骤中含有hWAPL基因最优选的克隆，编号为 RPll-383M14(chrlO 88159615. · 88339509)。根据本专利技术一个优选的实施方案，克隆培养和鉴定步骤中使用的STS引物对序列为上游引物 5’-ATGAATAGGCAGGCTGAGGATTT-3’ (SEQ ID NO 1)和下游引物 5’-TGACTCAGCCAAACCTTCTTAGG-3，(本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种辅助子宫颈癌早期诊断及治疗选择的hWAPL基因荧光原位杂交检测试剂盒，包括：1)杂交缓冲液、荧光标记探针混合物、未标记的竞争性DNA、DAPI复染剂，和2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其特征在于荧光标记探针混合物包含hWAPL基因探针和10号染色体着丝粒探针，每人份荧光标记探针混合物中GSP？hWAPL和CSP10因探针的使用量均为0.5μl。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李明，何瑰，陈华云，
申请(专利权)人：中山大学达安基因股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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