本发明专利技术公开了一种转基因玉米品系BT11的PCR-DHPLC检测引物及检测方法，所述引物具有较强的特异性，能够用于PCR扩增以及DHPLC分析。所述检测方法提供了一种操作简便、扩展性能好、灵敏度高的转基因玉米品系BT11检测方法。利用DHPLC对PCR扩增产物进行分析，其片段大小区分率可达数个碱基，分辨率高。本发明专利技术的引物和检测方法为转基因玉米品系BT11检测提供了一种简单、方便、有效、可靠的检测方法，特别适合用于口岸检验检疫等部门使用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种转基因产品的检测，特别是涉及一种转基因玉米品系的PCR-DHPLC检测弓I物及检测方法。
技术介绍
目前对转基因玉米的检测方法主要采用常规PCR、实时荧光PCR、PCR-基因芯片等检测方法。传统的常规PCR检测方法在平台扩展方面具有一定的局限性，随着待检目标的增加，需要对体系中的每套引物的用量及比例重新进行优化，并且兼顾扩增效率等因素，工作量较大；另一方面，通常采用的凝胶电泳分析扩增产物的方法，区分效率不高，检测结果不理想。实时荧光PCR虽然在检测灵敏度等方面较多重常规PCR检测方法有优势，但是由于目前仪器自身及荧光染料研制的限制，仅能同时提供互不干扰的4个荧光通道，也限制了 该技术在检测通量扩展。PCR-基因芯片检测方法，操作步骤繁琐，并不适合大规模的高通量检测。变性高效液相色谱技术(Denaturing High-performance Liquid Chromatography,DHPLC)是一种简单、快速、非凝胶的核酸分析方法，具有扩展性强、灵敏度高、分辨率好等优点。该方法在50°C条件下分析样品，样品峰的洗脱只由碱基对的数量决定洗脱顺序，当过柱的乙腈浓度提高，核酸片段会根据分子量从小到大的顺序被洗脱出来。通过得到的洗脱峰与marker比较确定分子量大小，判定是否含有目标检测基因。目前，尚没有转基因玉米品系BTll的PCR结合DHPLC的检测技术(PCR-DHPLC)。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于转基因玉米品系BTll的PCR-DHPLC检测的引物。本专利技术的另一目的是提供一种基于上述引物的扩展性能好、灵敏度和分辨率高的转基因玉米品系BTll的PCR-DHPLC检测方法。为实现上述目的，本专利技术采用了以下技术方案本专利技术公开了用于转基因玉米品系BTll的PCR-DHPLC检测的引物，所述引物的上游引物含有Seq ID No. I所示序列，下游引物含有Seq ID No. 2所示序列；Seq ID No. I :5’ -GCGCGGTGTCATCTATGTTACTA-3’Seq ID No. 2 :5，-GGTCGATGATAAATGGCCACA-3，。需要指出的是，上述Seq ID No. I和Seq ID No. 2是与转基因玉米品系BTll的检测靶标序列互补配对的特异序列，具有很强的特异性识别性。进一步的，所述上游引物的5’端还包括Seq ID No. 3所示序列，所述下游引物的5’端还包括Seq ID No. 4所示序列；Seq ID No. 3 :5，-CGTGGCCTCGCGATCTGACT-3’Seq ID No. 4 :5，-CTCAGCGGCGGAGCTACAGA-3，。需要指出的是，上述Seq ID No. 3和Seq ID No. 4是分别在上游引物和下游引物的5 ’端添加的与检测靶标序列无关的一段序列，该序列可以是与检测靶标序列同源性很远的其它物种的序列，也可以是一段随机生成的序列。该序列可以用于调控PCR扩增产物的大小，以便于PCR扩增产物的进一步分析。本专利技术中，优选的，所述上游引物具有Seq ID No. 5所示序列，下游引物具有SeqID No. 6所示序列；Seq ID No. 5 :5’ -CGTGGCCTCGCGATCTGACTGCGCGGTGTCATCTATGTTACTA-3’Seq ID No. 6 :5’ -CTCAGCGGCGGAGCTACAGAGGTCGATGATAAATGGCCACA-3’。需要说明的是，所述Seq ID No. 5和Seq ID No. 6序列是由 上述Seq ID No. I和Seq ID No. 2序列分别在其5’端添加调控序列而成，尽管上述已经说明Seq ID No. 3和SeqID No. 4所示调控序列可以是随机生成的序列，但是，并不是任意序列都可以添加，具体到本专利技术中，需要考虑调控序列与Seq ID No. I和Seq ID No. 2所示序列的理化性质的统一协调，并且还需要考虑添加调控序列后的Seq ID No. 3和Seq ID No. 4所示序列作为检测引物的整体性能。本专利技术还公开了一种用于转基因玉米品系BTll的PCR-DHPLC检测方法，所述检测方法包括采用上述引物，以玉米DNA为模板进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行变性高效液相色谱分析。进一步的,所述检测方法还包括以marker为参考标准进行变性高效液相色谱分析，将PCR扩增产物的变性高效液相色谱分析结果与marker的变性高效液相色谱分析结果进行比对。优选的上述检测方法包括如下步骤(A)采用上述引物，以玉米DNA为模板，进行PCR扩增；(B)以步骤(A)的PCR扩增产物为样品进行DHPLC分析，同时以marker为参考标准进行DHPLC分析；(C)将步骤⑶中样品的DHPLC分析结果与marker的DHPLC分析结果进行比较，确定样品的分子量大小，从而判断是否含有检测的靶标序列。由于采用以上技术方案，本专利技术的有益效果在于本专利技术的转基因玉米品系BTll检测引物具有较强的特异性，能够用于后续的多重PCR扩增以及DHPLC分析。本专利技术针对传统的电泳分析PCR扩增结果不理想的问题，将PCR与DHPLC相结合，提供了一种操作简便、扩展性能好、灵敏度和分辨率高的转基因玉米品系BTll检测方法。利用DHPLC对PCR扩增产物进行分析，对不同大小的PCR产物片段区分率可达数个碱基，甚至能够区分出I个碱基大小差异的片段。本专利技术的引物和检测方法为转基因玉米品系BTll检测提供了一种简单、方便、有效、可靠的检测方法，特别适合用于口岸检验检疫等部11使用。附图说明图为本专利技术实施例中DHPLC分析的部分结果；图中自上而下的曲线分别标记为M、1-18，]\1为11^11 51'、1为非转基因玉米0嫩、2为玉米皿例88017 DNA、3为玉米MIR604 DNA、4为玉米Btl76 DNA、5为玉米Btll DNA、6为玉米M0N810 DNA、7为玉米GA21 DNA、8为玉米 NK603 DNA、9 为玉米 M0N863DNA、10 为玉米 M0N89034 DNA、11 为玉米 T25 DNA、12 为大豆A2704-12DNA、13 为大豆 A5547-12 DNA、14 为油菜 DNA、15 为棉花 LLcotton25 DNA、16 为非转基因棉花DNA、17为Bt63 DNA、18为土豆EH92-527-1 DNA ；marker的各峰值从左至右依次为 80bp、102bp、174bp、257bp、267bp、296bp、434bp、458bp、587bp。具体实施例方式本专利技术公布了用于转基因玉米品系BTll的PCR-DHPLC检测的引物，该引物针对转基因玉米BTll品系的特异序列进行设计。进一步的，还在引物的上游和下游分别添加了一段与检测靶标序列无关或者同源性很远的调控序列，用于实现对扩增产物的片段大小的调控。需要指出的是，所述调控序列的加入只是为了获得更优异的检测效果，因此，本专利技术优选的，用于转基因玉米品系BTll的PCR结合DHPLC技术检测的引物是加入了调控序列 的引物，分别具有Seq ID No. 5至Seq ID No. 6本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于转基因玉米品系BT11?PCR?DHPLC检测的引物，其特征在于：所述引物的上游引物含有Seq?ID?No.1所示序列，下游引物含有Seq?ID?No.2所示序列；Seq?ID?No.1：5’?GCGCGGTGTCATCTATGTTACTA?3’Seq?ID?No.2：5’?GGTCGATGATAAATGGCCACA?3’。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：章桂明，向才玉，凌杏园，潘广，程颖慧，康林，李鹤遥，
申请(专利权)人：深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：
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