农作物转基因成份检测法及所用芯片制造技术

本发明专利技术公开了一种农作物转基因成份检测法，包括以下步骤：一、制备转基因成份检测芯片；针对转基因农作物的内源、外源、品系这三类基因，选择特异性探针，每条特异性探针的5'进行氨基修饰；然后将氨基修饰后的探针固定醛基玻片上，预杂交后，得转基因成份检测芯片；?二、检测：1）、利用已知标准，获取转基因片段的引物；2）、农作物待测样品中DNA的提取，得提取液；3）、靶基因的多重PCR扩增；4）、芯片杂交检测：将扩增产物与转基因成份检测芯片杂交；然后进行荧光探针杂交，再利用T4DNA连接酶进行酶连接，接着用NaOH变性，最后用洗液洗涤；?5）、杂交结果的检测与分析：扫描所得的芯片，对结果进行分析。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学检测技术，尤其是涉及大豆、玉米等相关产品的转基因成份检测。 
技术介绍
转基因，是指运用科学手段从某种生物中提取所需的基因，将其转入另一种生物中，使之与另一种生物的基因进行重组，从而产生特定的具有优良遗传性状的物质。利用转基因技术，可以改变动植物性状、培育新品种；也可以利用其他生物体培育出人类所需要的生物制品，用于医药、食品等方面。转基因是基因工程的重要组成部分。 全球转基因作物发展势头强劲。据专家提供的权威资料，2010  年全球转基因作物种植面积达到 1.48 亿公顷，是 1996 年的 87 倍，15 年间年均增长近 5 倍。1996 年全球种植转基因作物的国家仅 6 个，2010 年已达 29 个。4 大主要转基因作物种植面积也创新高。全球大豆面积的五分之四（81%）、棉花面积的三分之二（64%）、玉米面积的三分之一（29%）、油菜面积的四分之一（23%）种植的都是转基因品种。  全球有近 40 个国家和地区虽未正式批准转基因作物商业化种植，但允许进行试验研究或进口转基因作物原料用于饲料和食品加工。2010 年有 8 个欧盟成员国批准种植抗虫玉米等转基因作物；欧盟生物安全委员会宣布各国可自主决定是否种植转基因作物；瑞典首次批准种植转基因优质淀粉马铃薯。2008  年全球转基因作物产品总收益超过 1300 亿美元。 截至目前，中国共批准发放 7 种转基因植物的农业转基因生物安全证书，即1997 年发放的耐贮存番茄、抗虫棉花安全证书，1999 年发放的改变花色矮牵牛和抗病辣椒（甜椒、线辣椒）安全证书，2006  年发放的转基因抗病番木瓜安全证书，2009  年发放的转基因抗虫水稻和转基因植酸酶玉米安全证书。根据中国农业生物技术学会数据显示，2010 年中国种植转基因作物种植面积达到 350 万公顷，排名世界第六。其中转基因棉花约 330 万公顷，其余是转基因木瓜、转基因番茄、转基因辣椒等，所有作物都获得农业部颁发的转基因生物安全证书的农作物品种，是政策允许范围内种植的。 然而在安全性方面，有一些学者认为目前人类对基因的活动方式了解的还不够透彻，对控制基因调整后的结果没有十足的把握。当一种功能基因移入另一机体中，这种基因的功能可能发生不可预测的变化，而机体的相应反应更不可预测。 对于转基因作物的担心主要有两方面：（1）转基因生物对生物多样性的影响；（2）转基因生物对人体健康的威胁。 由于基因工程是一个新的领域，人们还难以完全准确地预测到转基因植物潜在危险性。虽然迄今已商品化的转基因食品尚无对人体有毒副作用的报道，但并非转基因植物完全没有不可预见的负效应。2001 年 5月，我国《农业转基因生物安全条例》开始实施, 要求对大豆、玉米、油菜类转基因食品必须加以标识。我国农业部 2003 年初在全国范围内进行转基因产品安全管理的执法大检查。按照国家农业部第 10 号令《农业转基因生物标识管理办法》规定，自 2003 年 3 月 20 日起，国家对农业转基因生物实行标识制度，要求对五大类 17 种农业转基因生物进行标识。但真的要使这些法规、制度得以实施，关键还在于有一个有效的检测技术。为此，科研人员分别从检测外源蛋白和检测外源 DNA 着手，建立了一系列检测方法。 
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种灵敏度高、操作简便、假阳性率低的农作物转基因成份检测法。 为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种农作物转基因成份检测法，包括以下步骤： 一、制备转基因成份检测芯片； 针对转基因农作物的内源、外源、品系这三类基因，选择特异性探针，每条特异性探针5'进行氨基修饰；然后将氨基修饰后的探针固定醛基玻片上，预杂交后，得转基因成份检测芯片； 二、检测： 依次进行以下步骤： 1）、利用已知标准，获取转基因片段的引物； 2）、农作物待测样品中DNA的提取，得提取液； 3）、靶基因的多重PCR扩增： 以步骤2）的提取液作为PCR模板，利用步骤1）所得的引物进行多重PCR扩增；得扩增产物； 4）、芯片杂交检测： 将扩增产物与转基因成份检测芯片杂交；然后进行荧光探针杂交，再利用T4DNA连接酶进行酶连接（即，利用T4DNA连接酶补齐），接着用NaOH变性，最后用洗液洗涤；  荧光探针为与特异性探针相对应的荧光探针； 5）、杂交结果的检测与分析： 用扫描仪扫描上述步骤4）所得的芯片，利用常规软件对结果进行分析。 作为本专利技术的农作物转基因成份检测法的改进： 步骤4）中： 进行荧光探针杂交的具体内容如下： 将浓度为2~3 μM的每种荧光探针等体积混合后，得荧光探针混合液；将荧光探针混合液与杂交液按1：1体积比混合后，与前述步骤所得的已经与扩增产物杂交的转基因成份检测芯片进行杂交；47~49℃孵育 29~31 分钟，室温静置8~12分钟； 杂交液由20×SSC 100ml、10% SDS 4ml、10% BSA 40ml和dd H 2O 276ml组成。 酶连接反应体系为： 0.05U/μl T4 连接酶反应液 1μl， T4 10×Buffer 2 μl；水（18.2兆欧姆的水）补足到 20μl； NaOH变性为：利用浓度为0.3M的NaOH溶液洗涤4~6分钟。 作为本专利技术的农作物转基因成份检测法的进一步改进： 步骤4）中的洗液为洗液(2×SSC，0.5％SDS)。 作为本专利技术的农作物转基因成份检测法的进一步改进： 荧光探针如下表所示： 。 在本专利技术中，步骤一（制备转基因成份检测芯片）的具体内容如下： 1）转基因片段的探针设计 对大豆、玉米、油菜等国家规定需检出的内源、外源、品系设计特异性扩增探针（即，特异性探针），每条特异性探针均必须符合以下条件：5'端需要氨基修饰，探针长度为20～30mer，探针之间Tm值差异在5度之内，各探针内部发夹结构≤5个、GC含量为40%～55%、重复的单一碱基的连续≤5个，分子最稳定的二级结构配对碱基长度少于6bp；于上海invitrogen公司合成。 上述特异性探针如表1所示。 农作物为大豆、玉米、油菜、大米等等。 2）、芯片制备： 将步骤1）所得到的特异性探针，用18.2兆欧姆的水稀释成30pmole/μl，然后与点样缓冲液等体积混匀，利用点样仪固定在醛基玻片上。然后放在100%相对湿度的密闭容器中，37℃水化 8 小时；70 ℃干燥 2 小时，洗液(2×SSC，0.5％SDS)洗两次，每次 5 分钟，水洗两次，每次 5 分钟，吹干片子，4℃保存，得到固定好探针的醛基玻片，备用。 固定好样本的醛基玻片预杂交：在玻片上加入预杂交液；37℃度孵育一小时，洗液(2×SSC，0.5％SDS)洗两次，每次 5 分钟，水洗两次，每次 5 分钟，吹干，待用。 预杂交液由20×SSC 100ml、10% SDS 4ml、10% 本文档来自技高网...

【技术保护点】
农作物转基因成份检测法，其特征是包括以下步骤：一、制备转基因成份检测芯片；针对转基因农作物的内源、外源、品系这三类基因，选择特异性探针，每条特异性探针的5“进行氨基修饰；然后将氨基修饰后的探针固定醛基玻片上，预杂交后，得转基因成份检测芯片；二、检测：依次进行以下步骤：？？？1）、利用已知标准，获取转基因片段的引物；？？？2）、农作物待测样品中DNA的提取，得提取液；3）、靶基因的多重PCR扩增：以步骤2）的提取液作为PCR模板，利用步骤1）所得的引物进行多重PCR扩增；得扩增产物；4）、芯片杂交检测：将扩增产物与转基因成份检测芯片杂交；然后进行荧光探针杂交，再利用T4DNA连接酶进行酶连接，接着用NaOH变性，最后用洗液洗涤；？所述荧光探针为与特异性探针相对应的荧光探针；5）、杂交结果的检测与分析：用扫描仪扫描上述步骤4）所得的芯片，利用常规软件对结果进行分析。

【技术特征摘要】
1.农作物转基因成份检测法，其特征是包括以下步骤：
一、制备转基因成份检测芯片；
针对转基因农作物的内源、外源、品系这三类基因，选择特异性探针，每条特异性探针的5'进行氨基修饰；然后将氨基修饰后的探针固定醛基玻片上，预杂交后，得转基因成份检测芯片；
二、检测：
依次进行以下步骤：
   1）、利用已知标准，获取转基因片段的引物；
   2）、农作物待测样品中DNA的提取，得提取液；
3）、靶基因的多重PCR扩增：
以步骤2）的提取液作为PCR模板，利用步骤1）所得的引物进行多重PCR扩增；得扩增产物；
4）、芯片杂交检测：
将扩增产物与转基因成份检测芯片杂交；然后进行荧光探针杂交，再利用T4DNA连接酶进行酶连接，接着用NaOH变性，最后用洗液洗涤； 
所述荧光探针为与特异性探针相对应的荧光探针；
5）、杂交结果的检测与分析：
用扫描仪扫描上述步骤4）所得的芯片，利...

【专利技术属性】
技术研发人员：张明哲，张晓峰，陈笑梅，吴姗，陈曦，
申请(专利权)人：浙江省检验检疫科学技术研究院，
类型：发明
国别省市：