本发明专利技术公开一种玉米核因子基因ZmNF-YA3在改变植物抗逆性中的应用。是从玉米中克隆出ZmNF-YA3基因，以正义或反义形式或RNAi结构形式将该基因重组到植物表达载体中，形成融合基因；利用转基因技术获得转基因植株；通过检测转基因表达和对植株进行抗逆性测定，从中筛选出抗逆性明显提高的转基因植株及其后代，创造出具有应用价值的植物新种质。其中所述玉米核因子基因ZmNF-YA3的cDNA序列如SEQ ID No.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；所述植物是指栽培的草本作物，或玉米，或棉花。本发明专利技术的应用对于培育高产抗逆转基因农作物具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属农作物的生物工程育种领域，具体说，涉及一种玉米核因子基因 ZmNF-YA3在改变植物抗逆性中的应用。
技术介绍
NF-Y(nuclear factor-y)是真核生物中普遍存在的一种转录因子复合物，由3个 不同的亚基（NF-YA/CBF-B/HAP2、NF-YB/CBF-A/HAP3 和 NF-YC/CBF-C/HAP5)组成，并通过作 用于其他调控因子的启动子来调节目的基因的表达。NF-YA是DNA序列特异性的亚基，结合 到基因启动子区的核心五聚体核苷酸CCAAT基序（motif)上。NF-YB和NF-YC是分别在结 构上类似组蛋白H2A和H2B的亚基。完整的NF-Y转录复合物与靶基因启动子中的CCAAT 基序结合，调控靶基因的转录。NF-Y复合体能够作为一个转录激活因子或阻遏因子起作用， 其与DNA的结合和转录调控活性也受到其它转录因子调节，后者通过与NF-Y亚基相互作用 起作用。植物NF-Y可分为NF-YA、NF-YB和NF-YC三个家族，每家族有8~39名成员，出现 了结构和功能的多样化，形成复杂的基因家族，且每个家族不同成员参与了不同调控。已有 的植物NF-Y基因功能分析揭示，三个家族的基因均有成员参与了植株生长发育调控或植 物与微生物相互作用，以及对逆境胁迫的响应。在进化过程中一些亚家族成员形成了参与 不同发育途径和代谢过程的特殊功能，如胚胎发育调控、根系发育和开花时间控制，内质网 应激调节、干旱胁迫响应、微生物感染及固氮根瘤形成等。一些植物NF-Y家族成员在抗旱、 耐盐性状上也有重要作用，过表达AtNF-YBl和ZmNF-YB2能够增强植物抗旱性。AtNF-YA5 被证明在干旱胁迫和响应脱落酸（ΑΒΑ)的拟南芥根和叶中表达上调。 玉米NF-Y家族基因数量大，检索玉米基因组序列，发现玉米CCAAT-HAP2/NF-YA家 族成员 36 个、CCAAT-HAP3/NF-YB 成员 28 个、CCAAT-HAP5/NF-YC 成员 25 个。这些 NF-Y 家 族基因的功能研究尚处起步阶段，只见到玉米ZmNF-YB2基因过表达提高了玉米植株耐旱 性的研究报道和孟山都公司申请的专利。有关玉米核因子基因 ZmNF-YA3在改变植物抗逆 性中的应用未见报道。
技术实现思路
针对目前的研究现状，本专利技术要解决的问题是提供一种玉米核因子基因 ZmNF_YA3 在改变植物抗逆性中的应用。 本专利技术所述的玉米核因子基因 ZmNF-YA3在改变植物抗逆性中的应用。 其中：所述玉米核因子基因 ZmNF-YA3的cDNA序列如SEQ ID No. 1所示，其编码的 氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示；所述植物是指栽培的草本作物，或玉米，或棉花；所述改 变植物抗逆性是指改变植物的抗旱性和/或耐热性。 上述应用中：所述玉米核因子基因 ZmNF-YA3基因有cDNA形式或该ZmNF-YA3基因 以正义形式、反义形式或其RNAi结构形式。 本专利技术所述玉米核因子基因 ZmNF_YA3在改变植物抗逆性中的应用方法是：从玉 米cDNA或基因组中克隆ZmNF-YA3基因序列，以基因全长形式或该基因以正义或反义形式、 或RNAi结构形式重组到植物表达载体中，形成融合基因，然后采用转基因技术将融合基因 导入植物细胞，获得转基因植株；其中，所述ZmNF-YA3基因以正义形式、反义形式或其RNAi 结构形式与启动子融合，该启动子有胁迫诱导型和/或组成型的。通过检测转基因表达强 度和对植株进行性状鉴定，从中筛选出生长和抗逆性发生明显改变的转基因植株及其后 代，创造出在植物育种中具有应用价值的植物新种质。具体的： 本专利技术中，首先以耐旱自交系齐319和干旱敏感自交系65232为材料，采用芯片杂 交技术比较苗期渗透胁迫处理（用18% PEG溶液浇灌沙培的3叶期玉米幼苗，分别在处理 后12h、24h、48h和恢复浇水后24h)对不同基因型转录组影响，选出了差异表达的在不同 基因型中变化趋势不同的转录因子。然后，采用定量RT-PCR技术对它们进行表达谱分析， 从中选出ZmNF-YA3/GRMZM5G857944基因进行转基因研究。在正常生长条件下ZmNF-YA3/ GRMZM5G857944基因在玉米根中的表达丰度大于叶中；在根中耐旱自交系齐319的表达丰 度是干旱敏感自交系65232的2. 5倍；在叶中齐319的表达量只有65232的1/2。渗透胁 迫处理24h时，在耐旱自交系齐319的叶片中表达丰度略有上升，而在根中大幅度下降，约 为处理前的1/9;在旱敏感自交系65232的叶和根中均显著下降，下降幅度约为30%。在渗 透胁迫处理48h，齐319的叶、根中ZmNF-YA3表达丰度变化不大，而在65232根和叶中表达 丰度有一定上升。复水24h后，在齐319的根中ZmNF-YA3表达迅速上升，在65232的根中 却明显下降；而在叶中ZmNF-YA3的表达丰度恢复到接近胁迫处理前的水平。即该基因表达 受渗透胁迫的调节，且在不同基因型中表达变化有差异，在根中是渗透胁迫抑制的，在叶中 对渗透胁迫反应因基因型不同而差异明显，推测它与玉米的根系生长发育及抗旱性有关。 本专利技术中，将ZmNF-YB3基因编码框分别与胁迫诱导型的启动子如Prd29B、Prd29A 等融合，重组到植物表达载体中，采用农杆菌介导法或基因枪轰击法将融合基因转入植物， 产生转基因株系。如在转基因玉米、棉花的产生中，构建出载体pCambial300-Prd29B: :ZmN F-YA3(+)-PCaMV35S: :bar 和 pCambial300-Prd29B: :ZmNF-YA3(-)-PCaMV35S: :bar，采用农 杆菌介导法或基因枪轰击法将目标质粒的T-DNA区转入玉米骨干自交系或棉花优良品种 中，转化苗移栽成活后自交，收获种子。通过除草剂抗性筛选和分子生物学检测方法（PCR、 Southern blotting、RT-PCR)检测转转化植株后代，产生转基因株系。继而通过连续3代 的自交和分子鉴定，产生了转基因纯合株系。另外，依据ZmNF-YA3基因特异序列，构建出 尺熟丨结构并重组到植物表达载体？?605941中，产生转化质粒？?605941^^(1298::2111即-￥八3 RNAi-PCaMV35S: :bar进行玉米遗传转化，获得转RNAi结构玉米植株。 本专利技术中，通过连续自交继代得到转基因纯合植株。首先，在正常栽培条件下确 定转基因植株生长发育是否正常，进而分析转基因植株和对照植株（转基因受体基因型植 株）在胁迫条件下的抗性差异。在正常栽培条件下转基因植株形态和生长发育正常，由于 启动子的特性，转基因 ZmNF-YA3或其反义结构或RNAi结构呈现胁迫诱导型表达。在转基 因玉米中，部分过表达株系在干旱或低温条件下ZmNF-YA3表达强度显著高于未转基因植 株的，而部分转反义基因或RNAi结构的玉米株系，内源ZmNF-YA3的表达受到明显抑制，即 ZmNF-YA3表达水平显著低于未转基因植株的。以下以转基因玉米株系为例简述本专利技术中抗 逆检测试验的基本步骤和方法。 在抗旱性实验中，将转ZmNF_YA3基因或它的RNAi结构的纯合本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种玉米核因子基因ZmNF‑YA3在改变植物抗逆性中的应用。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张举仁，李朝霞，王保梅，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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