本发明专利技术公开了百脉根AP2/ERF转录因子及其编码基因和应用，属于AP2/ERF转录因子及应用领域。本发明专利技术首先公开了从百脉根中分离的AP2/ERF转录因子基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，所编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术还公开了能够与顺式作用元件结合而启动抗逆应答基因表达的AP2/ERF转录因子结构域，其氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示。功能转化实验证明，在植物中过表达AP2/ERF转录因子基因能够显著提高转基因植株的耐盐性，说明其所编码蛋白具有AP2/ERF转录因子的功能。本发明专利技术AP2/ERF转录因子基因在提高植物对逆境胁迫的抗性中有重要应用前景。
【技术实现步骤摘要】
百脉根AP2/ERF转录因子及其编码基因和应用
本专利技术涉及转录因子，尤其涉及一种从百脉根(LotuscorniculatusL.)中分离的与抗逆相关的AP2/ERF转录因子，本专利技术还涉及所述转录因子在提高植物抗逆境胁迫中的应用，属于AP2/ERF转录因子及其应用领域。
技术介绍
土壤盐碱化和次生盐碱化问题在世界范围内广泛存在，特别是干旱、半干旱地区更为严重。土壤干旱、盐碱化严重阻碍了农作物的生长，降低了农作物的产量，已经成为制约世界灌溉农业可持续发展和影响生态环境的重要因素。百脉根(LotuscorniculatusL.)是世界范围内广泛种植的多年生优良豆科牧草，具有营养丰富、耐贫瘠、耐酸碱、耐牧和饲用安全、适口性好等优点。其不仅是建设生态农业的优质草种，还是用于土壤改良的重要作物，在用作地被植物、保持水土、改良人工草场、防止土壤荒漠化等方面具有独特作用。植物抗逆性是受多基因控制的复杂数量性状，单个基因表达的增强并不能从根本上改良植物对多种不良环境的抵抗能力，而转录因子(TranscriptionalFactors,TFs)是能够与真核生物基因启动子区域中顺式作用元件特异性结合，从而激活或抑制下游基因在特定时间和空间转录与表达的一类DNA结合蛋白，是目前抗逆研究最多、应用最广的一类基因。植物逆境抗性相关转录因子可以分：AP2/ERF、bZIP、WRKY、MYB、NAC五大类。其中AP2/ERF转录因子是植物特有的一大类超基因家族，具有非常保守的DNA结合域，特异性的与ERE、GCC-box等顺式元件结合，调控胁迫应答基因表达，是参与植物生长发育、生物/非生物胁迫应答基因表达及信号转导的重要转录调控因子。AP2/ERF超家族分为AP2、DREB、ERF、RAV和Soloist共5个亚家族，目前已有大量文献报道了DREB和ERF亚家族基因的功能与分子机制研究，但是有关单独亚家族(Soloist)文献报道还很少。因此，从优良豆科牧草百脉根中分离、鉴定AP2/ERF转录因子并分析其抗逆功能，对于农牧业生产、生态环境建设、土壤改良等方面均具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供从百脉根(LotuscorniculatusL.)中分离的AP2/ERF转录因子及其编码基因；本专利技术所要解决的另一个技术问题是提供含有上述编码基因的重组植物表达载体及含有该表达载体的宿主细胞；本专利技术所要解决的第三个技术问题是将所述AP2/ERF转录因子及其编码基因应用于提高植物对逆境胁迫的抗性。为解决上述技术问题，本专利技术所采取的技术方案是：本专利技术首先公开了从百脉根(LotuscorniculatusL.)中分离的AP2/ERF转录因子编码基因(命名为：LcAP2/ERF107)，其多核苷酸为(a)、(b)、(c)、(d)或(e)所示：(a)、SEQIDNO.1所示的多核苷酸；或(b)、编码SEQIDNO.2所示氨基酸的多核苷酸；或(c)、与SEQIDNO.1的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸，该多核苷酸所编码蛋白质仍具有AP2/ERF转录因子功能；或(d)、与SEQIDNO.1所示的多核苷酸至少有90％或以上同源性的多核苷酸；或(e)、在SEQIDNO.1所示的多核苷酸的基础上进行一个或多个碱基的缺失、取代或插入的多核苷酸变体，且该多核苷酸变体所编码的蛋白仍具有AP2/ERF转录因子的功能或活性。本专利技术上述LcAP2/ERF107转录因子编码基因编码的AP2/ERF转录因子，其氨基酸为(a)或(b)所示：(a)、SEQIDNO.2所示的氨基酸；(b)、将SEQIDNO.2所示的氨基酸通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或/和插入而衍生得到的仍具有AP2/ERF转录因子功能或活性的蛋白变体。其中，SEQIDNO.2的氨基端第108至159位氨基酸残基序列为AP2/ERF结合域的编码序列(SEQIDNO.3所示)，该结合域第14位(第121位)氨基酸为丙氨酸(A)，第19位(第126位)氨基酸为天冬氨酸(D)，此类结构域能够与GCCbox顺式作用元件结合而启动抗病防卫基因或抗逆应答基因的表达。本专利技术所述的蛋白变体可由遗传多态性或人为操作产生，这些操作方法通常为本领域所了解。例如，可通过DNA的突变来制备AP2/ERF转录因子的氨基酸序列变体或片段，其中用于诱变或改变多核苷酸的方法为本领域所习知。其中，保守的取代是将一种氨基酸残基替换成具有相似性质的另一种氨基酸。本专利技术所述的LcAP2/ERF107转录因子编码基因包括天然存在的序列和变体两种形式。“变体”意指基本相似的序列，对于多核苷酸，变体包含天然多核苷酸中一个或多个位点处一个或多个核苷酸的缺失、插入或/和替换。对于多核苷酸，保守的变体包括由于遗传密码的简并性而不改变编码的氨基酸序列的那些变体。诸如此类天然存在的变体可通过现有的分子生物学技术来鉴定。变体多核苷酸还包括合成来源的多核苷酸，例如采用定点诱变所得到的仍编码SEQIDNO.2所示的氨基酸的多核苷酸变体，或者是通过重组的方法(例如DNA改组)。本领域技术人员可通过以下分子生物技术手段来筛选或评价变体多核苷酸所编码蛋白的功能或活性：DNA结合活性、蛋白之间的相互作用，瞬时研究中基因表达的激活情况或转基因植物中表达的效应等。本专利技术将SEQIDNO.2所示的氨基酸(LcAP2/ERF107转录因子)与拟南芥、水稻的同源AP2/ERF的氨基酸序列进行多序列比对，构建进化树，结果表明LcAP2/ERF107与拟南芥单独亚家族(Soloist)的At4g13040同源关系最近。因此，LcAP2/ERF107是单独亚家族的新基因。本专利技术还公开了含有所述LcAP2/ERF107转录因子编码基因的重组表达载体以及含有所述重组表达载体的重组宿主细胞；其中，所述重组表达载体是重组植物表达载体。将所述LcAP2/ERF107转录因子编码基因可操作的与表达调控元件相连接，得到可以在植物中表达该编码基因的重组植物表达载体；该重组植物表达载体可以由5′端非编码区，SEQIDNO.1所示的核苷酸和3′非编码区组成；其中，所述的5′端非编码区可以包括启动子序列、增强子序列或/和翻译增强序列；所述的启动子可以是组成性启动子、诱导型启动子、组织或器官特异性启动子；所述的3′非编码区可以包含终止子序列、mRNA切割序列等。合适的终止子序列可取自根癌农杆菌的Ti-质粒，例如章鱼碱合成酶和胭脂碱合成酶终止区。另外，本领域技术人员可以将SEQIDNO.1所示的核苷酸进行优化以增强在植物中的表达效率。例如，可采用目标植物的偏爱密码子进行优化来合成多核苷酸以增强在目标植物中的表达效率。所述重组植物表达载体还可含有用于选择转化细胞的选择性标记基因，用于选择经转化的细胞或组织。标记基因包括：编码抗生素抗性的基因以及赋予除草化合物抗性的基因等。此外，所述的标记基因还包括表型标记，例如β-半乳糖苷酶和荧光蛋白等。本专利技术还涉及将所述的LcAP2/ERF107转录因子编码基因引入到植物中以提高植物对逆境胁迫的抗性。本专利技术公开了一种提高植物对逆境胁迫抗性的方法，包括以下步骤：(1)构建含有从百脉根中分离的LcAP2/ERF107转录因子编码基因的重组植物表本文档来自技高网...
【技术保护点】
从百脉根(Lotus corniculatus L.)中分离的AP2/ERF转录因子编码基因，其特征在于，其多核苷酸为(a)、(b)、(c)、(d)或(e)所示：(a)、SEQ ID NO.1所示的多核苷酸；或(b)、编码SEQ ID NO.2所示氨基酸的多核苷酸；或(c)、与SEQ ID NO.1的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸，该多核苷酸所编码蛋白质仍具有AP2/ERF转录因子功能；或(d)、与SEQ ID NO.1所示的多核苷酸至少有90％或以上同源性的多核苷酸；或(e)、在SEQ ID NO.1所示的多核苷酸的基础上进行一个或多个碱基的缺失、取代或插入的多核苷酸变体，且该多核苷酸变体所编码的蛋白仍具有AP2/ERF转录因子的功能或活性。
【技术特征摘要】
1.从百脉根(LotuscorniculatusL.)中分离的AP2/ERF转录因子编码基因，其特征在于，其多核苷酸为(a)或(b)所示：(a)、SEQIDNO.1所示的多核苷酸；或(b)、编码SEQIDNO.2所示氨基酸的多核苷酸。2.权利要求1所述编码基因编码的AP2/ERF转录因子，其特征在于，其氨基酸序列为SEQIDNO.2所示。3.与顺式作用元件结合而启动抗病防卫基因或抗逆应答基因的表达的AP2/ERF转录因子的结构域，其特征在于：其氨基酸序列为SEQIDNO.3所示。4.含有权利要求1所述编码基因的重组表达载体。5.按照权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体是重组植物表达载体。6.权利要求1所述的编码基因在提高植物对逆境胁迫抗性中...
【专利技术属性】
技术研发人员：许建新，吴燕民，雷江丽，孙占敏，李诗刚，周美亮，赵亮，李金博，唐益雄，
申请(专利权)人：深圳市铁汉生态环境股份有限公司，中国农业科学院生物技术研究所，深圳市中国科学院仙湖植物园，
类型：发明
国别省市：广东;44
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