本发明专利技术公开一种实时荧光RCA技术同步检测10种转基因玉米品系的试剂盒、及其使用方法，属于转基因食品检测技术领域，其通过锁式探针RCA技术与实时荧光PCR技术相结合，建立了实时荧光PCR-锁式通用探针滚环扩增（RCA），针对10种转基因玉米品系分别设计锁式探针SEQ?ID?NO：1~10，通过滚环扩增技术与待检测样品中的靶标序列互补结合,在连接酶作用下使探针环化;进一步通过滚环扩增的通用引物区,实现环状锁式探针的级联扩增;本发明专利技术试剂盒具有高通量、特异性、准确性、高灵敏等特点，锁式探针独特的设计，满足了专化性检测的需要，而且可以结合多种扩增方式及检测标记物，适应多种检测平台，填补了国内外空白。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于转 基因食品检测
，具体涉及实时荧光RCA技术同步检测10种转基因玉米品系的试剂盒、及其在检测转基因玉米品系中的应用。
技术介绍
随着现代生物技术的发展，转基因食品已逐步进入普通百姓的生活。由于转基因食品所具有的潜在非安全性，为保护广大消费者的权益，满足其选择权和知情权以及出于国际贸易的需要，转基因食品的检测越来越引起各国政府和有关食品监督机构的重视。目前转基因产品检测方法分为两大类I、免疫学检测法免疫学检测法是从蛋白质水平对转基因食品进行检测，即对外源蛋白质的测定。可将其分为Western杂交、酶联免疫法(ELISA)、试纸条法和快速检测试剂盒法。免疫学检测法，其基本原理是通过抗原(antigen)抗体(antibody)之间的特异性反应来实现的。这种方法的不足在于第一，由于抗原抗体反应的专一性，因此一种试剂盒只针对一特定转基因产物，无法高通量、快速的检测具有多种混合成分的食品样品；第二，加工过的转基因食品中的蛋白质抗原性很容易破坏，从而影响检测结果的准确性；第三，有些转基因食品不表达蛋白质或表达量很低或很大时，则无法进行检测。2、PCR 检测法PCR检测法是目前转基因存在的检测方法中最为成熟的，它具有灵敏度高、特异性强、可准确定量等优点。现阶段常用的PCR技术有定性PCR，定量竞争性PCR和实时荧光定量PCR，PCR-ELISA，巢式扩增PCR和复合扩增PCR。但该项技术的检测结果也有可能与实际不相符合，会出现假阴性或假阳性结果，即检测物质本身含有转基因物而未被检出，或是本身没有转基因物质，而检出有转基因成份。目前，由于我国的转基因玉米涉及到的品系种类较多，靶标、序列结构各不相同，若单一品系逐个检测则存在着检测成本高、操作繁琐的问题。为了克服上述现有技术的不足，通过研究，解决了锁式通用探针和特异引物分子设计与筛选的难题，设计、筛选了实时荧光-滚环扩增(RCA)技术检测中的锁式通用探针和特异引物分子，设计、验证了锁式探针的两臂特异序列。首次探索了锁式探针RCA技术与实时荧光PCR技术相结合，建立了实时荧光PCR-锁式通用探针滚环扩增(RCA)JP :实时荧光RCA，同步检测10种转基因玉米品系的高通量、特异性、准确性、高灵敏的检测技术，填补了国内外空白。
技术实现思路
本研究的目的在于提供一种基于滚环扩增技术检测转基因物种的方法。该方法应用一种锁式探针，包括以下3个部分5’端Tl和3’端T2为检测臂，与靶标序列互补结合，可在连接酶作用下使探针环化；Pl和P2为滚环扩增的通用引物区，实现环状锁式探针的级联扩增；5’端和3’端之间的与检测无关的连接序列，或用于基因芯片的Zip区，实现探针与基因芯片上固体支持物的特异结合，锁式探针的结构如图4所示如果体系中存在检测的靶序列，锁式探针的两个检测臂就能与靶序列结合，在连接酶的作用下其两个末端被连接起来，形成环化的锁式探针，由于锁式探针和靶序列的杂交会产生较为稳定的拓扑结构，因而也保证了环化探针的稳定性。环化的锁式探针可以通过通用引物进行扩增，实现检测信号的放大以及多元检测。如果体系中不存在需要检测的靶序列，线形锁式探针就不会被连接酶连接形成环化的锁式探针，也就不会被通用引物扩增。锁式探针独特的设计，满足了专化性检测的需要，而且可以结合多种扩增方式及检测标记物，适应多种检测平台。本专利技术的目的检测未知样品中，是否含有所述的10种转基因玉米的品系中的一种或多种，即抗虫和耐除草剂玉米Btll、抗虫和耐除草剂玉米Btl76、抗虫和耐除草剂玉 米TC1507、抗虫玉米M0N810、抗虫玉米M0N863、耐除草剂玉米GA21、耐除草剂玉米NK603、耐除草剂玉米T25、抗虫玉米CBH351、抗虫玉米M0N89034 ；专利技术方案①搜集上述10种转基因玉米的品系的特异性基因序列，并且设计了 10对锁式探针，人工合成并备用。②对样品提基因组一消化基因组一与锁式探针连接一利用通用引物放大检测信号一Roche Lightcycler 480II检测系统数据分析一给出结论。通过滚环扩增技术与待检测样品中的靶标序列互补结合，在连接酶作用下使探针环化；进一步通过滚环扩增的通用引物区，实现环状锁式探针的级联扩增。本专利技术的技术方案有以下几方面本专利技术的一方面在于，公开一种转基因玉米品系检测试剂盒，包括锁式探针序列SEQ ID NO :1 10中至少一种。本专利技术的另一方面在于，公开一种转基因玉米品系检测试剂盒，包括锁式探针序列SEQ ID NO : I 10中至少一种以及SEQ ID NO :11 12中至少一种。所述的SEQ ID NO:1Γ12可以+作为阳性对照，因此阳性对照可以选择某一个或两个联合使用。本专利技术的另一方面在于，公开一种转基因玉米品系检测试剂盒，包括十种锁式探针序列SEQ ID NO Γ10以及可以作为阳性对照的SEQ ID NO Γ 2中的至少一种。本专利技术的另一方面在于，公开一种转基因玉米品系检测试剂盒，其包括锁式探针序列 SEQ ID NO Γ 2ο根据待测样品中可能存在哪些转基因玉米品系的品种，选择相应的锁式探针制成试剂盒，用以检测待测样品中是否含有相应的玉米品种。因此，根据本专利技术的第一、二个技术方案，本领域技术人员可以制备出多种检测某一种或某几种转基因玉米品系的试剂盒，也可以根据本专利技术的第三、四个技术方案制备一种能够同时检测十种转基因玉米品系的试剂盒，上述检测试剂盒中，采用了开放式的描述形式，其含义是均未限定检测试剂盒中的其他缓冲液等成分，因其可根据现有技术确定，并通过配置或商业途径购买获得，检测试剂盒的使用方法和检测条件，技术人员可以依据实施例中所列条件做参考依据进行调整。这些关于制剂方式和方法的选择，相信本领域技术人员可以从现有技术中得到充分的启示，本专利技术不再赘述。通常试剂盒的使用过程中，引物和探针的终浓度可依照实施例确定出经验值，有必要时，也可进行多浓度测试，以确定最佳的添加量。DNA模板的添加量因不同种类的DNA模板的溶液中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定最佳的DNA模板添加量。本专利技术的另一方面在于，公开一种转基因玉米品系检测试剂盒，其中，除了包括前几个技术方案中所示的锁式探针之外，还包括通用引物SEQ ID N0:13和SEQ ID NO 140 设计通用引物的目的是使得环 化的锁式探针通过通用引物进行扩增，实现检测信号的放大以及多元检测。例如可以参考实施例中的方法——通过实时荧光PCR反应，控制反应条件，并实时监测熔解曲线，通过熔解曲线判断PCR扩增的特异性，判断反应产物的条带数目。也可以根据熔解温度(熔解曲线)区分不同的扩增片段，以达到检测不同种转基因玉米品系的作用。本专利技术的另一方面在于，公开一种实时荧光RCA同步检测转基因玉米品系的方法，其操作步骤包括①将转基因玉米品系的干燥种子研磨成粉末，然后分别提取基因组DNA ；其中，上述步骤①中，提取基因组DNA的方法为本领域技术人员的常规操作，具体过程如下称取50mg样品用于DNA提取；加入150 μ L超纯水、350 μ L CTAB缓冲液、10 μ L20mg/ml蛋白酶K, 65°C孵育3h ；14, OOOrpm离心5min后，取上清液，加入5 μ L的I本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种转基因玉米品系检测试剂盒，其特征在于包括锁式探针序列SEQ ID NOΓ10中至少一种。2.根据权利要求I所述的一种转基因玉米品系检测试剂盒，其特征在于包括锁式探针序列SEQ ID NO Γ10中至少一种以及SEQ ID NO : 11 12中至少一种。3.根据权利要求2所述的一种转基因玉米品系检测试剂盒，其特征在于包括锁式探针序列SEQ ID NO Γ10以及SEQ ID NO : 11 12中至少一种。4.根据权利要求3所述的一种转基因玉米品系检测试剂盒，其特征在于包括下述锁式探针序列SEQ ID NO Γ1205.如权利要求广4中任一项所述的一种转基因玉米品系检测试剂盒，其特征在于还包括通用引物SEQ ID Ν0:13和SEQ ID NO :14。6.一种同步检测转基因玉米品系的方法，其操作步骤包括 ①将待测转基因玉米品系的干燥种子研磨成粉末，分别提取基因组DNA； ②基因组DNA的消化 取步骤①获得的基因组DNA 1500ng，于37°C过夜消化；再95°C加热IOmin使酶失活；其中，消化反应...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐君怡，曹际娟，赵昕，曹冬梅，
申请(专利权)人：徐君怡，曹际娟，赵昕，曹冬梅，
类型：发明
国别省市：
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