增强腺相关病毒载体功能的方法技术

本发明专利技术提供了一种在选定的腺相关病毒(AAV)序列中校正单现突变从而提高选定AAV的包装产量、转导效率和/或基因转移效率的方法。该方法包括改变亲代AAV衣壳中的一个或多个单现突变，使它们与用来比对的功能性AAV衣壳序列中相应位点上的氨基酸相一致。

Method for enhancing function of adeno-associated virus vector

The present invention provides a method for correcting a single mutation in a selected adeno-associated virus (AAV) sequence, thereby improving packaging yield, transduction efficiency, and / or gene transfer efficiency of selected AAV. The method comprises the alteration of one or more single mutations in the parental AAV capsid, consistent with the amino acid on the corresponding site of the functional AAV capsid sequence for comparison.

【技术实现步骤摘要】
增强腺相关病毒载体功能的方法本申请是国际申请PCT/US2006/013375，国际申请日2006年4月7日，中国国家阶段申请号200680010566.6，名称“增强腺相关病毒载体功能的方法”的专利技术专利申请的分案申请。专利技术背景腺相关病毒(AAV)是细小病毒科(Parvovirus)家族的一个成员，它是小的无包膜、二十面体病毒，具有4.7千碱基(kb)到6kb的单链线性DNA基因组。由于该病毒是作为纯化的腺病毒原种的污染物被发现的，AAV指定为依赖病毒属(Dependovirus)。AAV的生命周期包括潜伏期(AAV基因组在感染后位点特异性整合入宿主染色体)，感染期(腺病毒或单纯疱疹病毒感染后，整合的基因组接着得到拯救、复制并包装入感染的病毒)。非致病性、宽宿主范围(包括非分裂细胞)感染性以及潜在的位点特异性染色体整合的特性使得AAV成为用于基因转移的有吸引力的工具。已经描述AAV载体用于治疗用和免疫原性分子的运载工具。迄今为止，已从人或非人灵长类(NHP)中分离了几种表征良好的不同AAV。最近，研究者描述了不同序列的大量AAV[G.Gao等人，ProcNatlAcadSciUSA，100(10):6081-6086(2003年5月13日)；US-2003-0138772-A1(2003年7月24日)]，并且将这些AAV表征为不同的血清型和分化体[G.Gao等人，J.Virol.，78(12):6381-6388(2004年6月)；国际专利公开号WO2005/033321]。已报道不同的AAV表现出不同的转染效率，也表现出对不同细胞或组织的趋性。想要得到用于向不同细胞类型递送异源分子的基于AAV的构建体。专利技术概述本专利技术提供了一种用于改善无功能和/或功能弱的AAV载体的方法。一方面，该方法提供了一种在选定的腺相关病毒(AAV)序列中校正单现突变(singleton)以提高选定AAV的包装产量、转导效率和/或基因转移效率的方法。该方法包括改变亲代AAV衣壳中的一个或多个单现突变使所述单现突变与用来比对的功能性AAV衣壳序列中对应位点的氨基酸相一致。另一方面，本专利技术提供了经修正的AAV序列，即除去一个或多个单现突变的序列。又一方面，本专利技术提供了具有根据本专利技术修正的AAV衣壳的AAV载体。下述专利技术详述容易地表现出本专利技术的其他方面和优点。附图简述图1显示经单现突变校正的AAV载体的体外293转导。在载体名称之后标明了单现突变的校正(如果存在的话)，数字表示突变的数目。图2A-2C显示用293细胞测定的AAV载体在感染复数范围为101到104的滴度，其中，图2A比较亲代rh.8和经单现突变校正的rh.8(rh.8R)，图2B比较亲代rh.37和经修正的rh.37，图2C比较AAV2和AAV8。作为对照，还给出了AAV2和AAV2/8eGFP表达载体的相似滴定的结果。Y轴表示以流式细胞计数法测定的eGFP阳性细胞百分比(％)。图3是AAV序列的系统发生树，显示了它们的系统发生关系和所属分化体。图4A-4L是AAV2[SEQIDNO:7]、cy.5[SEQIDNO:8]、rh.10[SEQIDNO:9]、rh.13[SEQIDNO:10]、AAV1[SEQIDNO:11]、AAV3[SEQIDNO:12]、AAV6[SEQIDNO:13]、AAV7[SEQIDNO:14]、AAV8[SEQIDNO:15]、hu.13[SEQIDNO:16]、hu.26[SEQIDNO:17]、hu.37[SEQIDNO:18]、hu.53[SEQIDNO:19]、rh.39[SEQIDNO:20]、rh.43[SEQIDNO:21]和rh.46[SEQIDNO:22]的衣壳蛋白(vp1)核酸序列的比对。图5A-5D是AAV2[SEQIDNO:23]、cy.5[SEQIDNO:24]、rh.10[SEQIDNO:25]、rh.13[SEQIDNO:26]、AAV1[SEQIDNO:27]、AAV3[SEQIDNO:28]、AAV6[SEQIDNO:29]、AAV7[SEQIDNO:30]、AAV8[SEQIDNO:31]、hu.13[SEQIDNO:32]、hu.26[SEQIDNO:33]、hu.37[SEQIDNO:34]、hu.53[SEQIDNO:35]、rh.39[SEQIDNO:36]、rh.43[SEQIDNO:37]和rh.46[SEQIDNO:38]的衣壳蛋白(vp1)氨基酸序列的比对。图6A-6B是rh.13[SEQIDNO:26]、rh.2[SEQIDNO:39]、rh.8[SEQIDNO:41]、hu.29[SEQIDNO:42]和rh.64[SEQIDNO:43]的衣壳蛋白(vp1)氨基酸序列的比对。专利技术详述本专利技术提供了一种改善AAV载体功能的方法。本专利技术尤其适合于改善衣壳含一个或多个单现突变的AAV载体的包装产量、转导效率和/或基因转移效率。本专利技术进一步提供了根据本专利技术的方法鉴定和制备的新AAV衣壳序列。本说明书与权利要求书使用的术语“包含/含有”和“包括”包括其他成分、元素、数值、步骤等等在内。相反，术语“由...组成”和其变体不包括其他成分、元素、数值、步骤等等在内。本专利技术的单现突变方法如本文中所用的术语“单现突变(singleton)”指在选定的(即亲代)AAV衣壳序列中的给定位点上的可变氨基酸。通过将亲代AAV衣壳序列与功能性AAV衣壳序列文库比对来确定可变氨基酸的存在。然后分析序列来确定亲代AAV衣壳中所有这样的可变氨基酸序列：功能性AAV文库中的AAV序列在此氨基酸位置完全保守。然后改变亲代AAV序列，将单现突变改变为经鉴定功能性AAV衣壳序列在该位点上的保守氨基酸。根据本专利技术，亲代AAV序列可能具有1-6、1-5、1-4、1-3或2个单现突变。亲代AAV序列也可能具有超过6个单现突变。一旦修正后，经修正的AAV衣壳可用于构建具有经修正衣壳的AAV载体。可使用本领域技术人员公知的技术来构建载体。根据本专利技术方法所选择的用于修正的AAV是想要与亲代AAV相比增强其下列三种功能特性之一或多种的AAV，所述的三种功能特性即：包装成具有选定AAV序列的衣壳的病毒粒子，提高转导效率或增加基因转移效率。例如，与密切相关的其他AAV相比，亲代AAV的特征可能在于具有较低的包装效率。在另一个实例中，与密切相关的AAV相比，亲代AAV可能具有较低的转导效率。在另一个实例中，与密切相关的AAV相比，亲代AAV可能具有较低的基因转移效率(即：体内递送靶分子的能力较低)。在其他的实例中，亲代AAV的上述各项功能都合格，但有待进一步提高其中一项或多项功能。因此，本专利技术提供了一种功能性AAV的文库，其中AVV的序列与选定的(亲代)AAV形成对照。适宜的是，该文库包含具有目标功能的AAV，该目标功能正是欲在选定亲代AAV实现的改善。换句话说，该功能性AAV文库的每一序列的特征在于具有目标水平的包装能力、目标水平的体外转导效率或目标水平的体内基因转移效率(即：在对象中向选定靶组织或细胞的递送能力)。组成文库的功能性AAV可分别具有这些功能性特征中的一种、两种或全部。本领域技术人员可容易地确定文库的其他目标功能。在本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种腺相关病毒(AAV)载体，具有经修饰的AAVrh48衣壳(rh48.2)，所述经修饰的衣壳具有经修饰的SEQ ID NO:44所示氨基酸序列，其中氨基酸残基位点304处的原丝氨酸改为天冬酰胺。

【技术特征摘要】
2005.04.07 US 60/669,083;2005.11.04 US 60/733,4971.一种腺相关病毒(AAV)载体，具有经修饰的AAVrh48衣壳(rh48.2)，所述经修饰的衣壳具有经修饰的SEQIDNO:44所示氨基酸序列，其中氨基酸残基位点304处的原丝氨酸改为天冬酰胺。2.如权利要求1所述的AAV载体，所述衣壳还具有以下修饰：SEQIDNO:44第217位的原赖氨酸改为谷氨酸。3.如权利要求1或2所述的AAV载体，所述载体携有编码基因产物的转基因，所述转基因受指导其在宿主细胞内表达的调控序列的调控。4.一种组合物，包含如权利要求1-3中任一项所述的AAV载体和生理相容载体。5.如权利要求1-3中任一项所述的AAV载体或如权利要求4所述的组合物，它们是用于向对象递送基因产物。6.一种核酸分子，其中的核酸序列编码经修饰的AAVrh48衣壳，所述经修饰的衣壳具有经修饰的SEQIDNO:44所示氨基酸序列，其中氨基酸残基位点304处的原丝氨酸改为天冬酰胺。7.如权利要求6所述的核酸分子，所述AAVrh48衣壳还具有以下修饰：SEQIDNO:44第217位的原赖氨酸改为谷氨酸。8.一种腺相关病毒(AAV)载体，具有选自以下的AAVhu48衣壳：(a)具有经修饰SEQIDNO:50所示氨基酸序列的hu48衣壳，其中氨基酸残基位点277处的原甘氨酸改为丝氨酸、氨基酸残基位点322处的原谷氨酸改为赖氨酸、氨基酸残基位点552处的原丝氨酸改为天冬酰胺；和(b)具有经修饰SEQIDNO:50所示氨基酸序列的hu48衣壳，其中氨基酸残基位点277处的原甘氨酸改为丝氨酸、氨基酸残基位点322处的原谷氨酸改为赖氨酸。9.如权利要求8所述的AAV载体，所述衣壳是具有以下修饰的SEQIDNO:50所示氨基酸序列的hu48衣壳：(a)氨基酸残基位点277处的原甘氨酸改为丝氨酸、氨基酸残基位点322处的原谷氨酸改为赖氨酸、氨基酸残基位...

【专利技术属性】
技术研发人员：L·范登伯格，G·高，J·M·威尔森，
申请(专利权)人：宾夕法尼亚大学托管会，
类型：发明
国别省市：美国,US