表达神经退行性疾病保护肽的AAV9-CIP病毒及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种表达神经退行性疾病保护肽的AAV9‑CIP病毒的制备方法，包括以下步骤：步骤1：设计Myc‑CIP引物，得到Myc‑CIP基因片段；步骤2：得到质粒pCR2.1‑Myc‑CIP；步骤3：得到质粒pEGFP‑C2‑Myc‑CIP；步骤4：得到质粒pAAV‑hSynapsin‑GFP‑Myc‑CIP；步骤5：得到AAV9‑CIP病毒。本发明专利技术的目的在于提供一种能在中枢神经系统神经元细胞中特异表达的神经退行性疾病保护肽的AAV9‑CIP病毒，由于CIP能特异抑制神经系统退行性疾病病变过程中产生的神经毒性复合物CDK5/p25,因此本发明专利技术建立了能用于神经系统退行性疾病如阿尔兹海默病、帕金森病等的靶向干预治疗CIP病毒，同时本发明专利技术还公开了一种表达神经退行性疾病保护肽的AAV9‑CIP病毒的制备方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及医疗领域，具体地说是一种表达神经退行性疾病保护肽的AAV9-CIP病毒及其制备方法。
技术介绍
目前人体及动物实验研究证明CDK5/p25的高活性在神经退行性疾病如阿尔兹海默病、帕金森病疾病、脊髓侧索硬化、卒中等神经元损伤过程中起到重要病理作用。CIP为p25末端的125个氨基酸残基片段，在体外神经元的保护实验及CIP转基因鼠和阿尔兹海默病疾病鼠模型杂交研究发现CIP肽能特异抑制CDK5/p25的毒性而对神经元起保护作用。但因CIP分子量过大(13.8kDa)，不能通过血脑屏障，因此难以用于临床转化。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种表达神经退行性疾病保护肽的AAV9-CIP病毒，建立用于神经系统退行性疾病如阿尔兹海默病等的通过AAV病毒表达的抑制CDK5/p25的肽CIP，同时本专利技术还公开了一种表达神经退行性疾病保护肽的AAV9-CIP病毒的制备方法。本专利技术的具体的技术方案为：一种表达神经退行性疾病保护肽的AAV9-CIP病毒的制备方法，包括以下步骤：步骤1：设计Myc-CIP引物，以pcDNA3.1-C-p35为模板通过PCR反应得到Myc-CIP基因片段；步骤2：将Myc-CIP基因片段插入到pCR2.1TOPO载体中，通过连接反应得到质粒pCR2.1-Myc-CIP；步骤3：将Myc-CIP基因片段以内切酶从pCR2.1-Myc-CIP切出并插入到pEGFP-C2载体的多克隆位点，得到质粒pEGFP-C2-Myc-CIP；步骤4：将GFP-Myc-CIP基因片段从质粒pEGFP-C2-Myc-CIP中切出，替代pAAV-hSynapsin-eGFP质粒的eGFP基因片段，得到质粒pAAV-hSynapsin-GFP-Myc-CIP；步骤5：将病毒表达质粒pAAV-hSynapsin-GFP-Myc-CIP、腺相关病毒包装质粒pAAV2/9和辅助质粒pHelper共转染到人胚肾293(HEK293)细胞中，转染72小时后收集含有病毒的细胞及培养液，对后者进行纯化分离得到AAV9-CIP病毒。在上述的表达神经退行性疾病保护肽的AAV9-CIP病毒的制备方法中，步骤1中设计Myc-CIP引物具体为：在PCR反应管中加入：10×ExTaqBuffer(Mg2+Plus)体积为5体积份；dNTPMixture(各2.5mM)体积为4体积份；DNA聚合酶TaKaRaExTaq(浓度为5U/μl)体积为0.5体积份；Myc-CIP-5’端引物(100uM)体积为1.5体积份；Myc-CIP-3’端引物(100uM)体积为1.5体积份；pcDNA3.1-C-p35质粒模板(100ng/ul)体积为1体积份；加水至步骤1中的体积为50体积份；按照TaKaRaExTaqPCR反应试剂盒条件进行PCR扩增，得到Myc-CIP基因片段。从其原理上来说：先按照基因p35序列(全长1-924碱基对，见附加说明)对应的CIP序列位置(第460-837碱基)设计PCR扩增CIP基因片段的5’和3’端引物，5’引物序列除开与CIP序列第460-479碱基)完全相同的序列外，并在5’引物端引进了限制性内切酶ECORI酶切点和Myc序列，3’引物序列除开与CIP序列末端完全互补，并在其3’端加XbaI的酶切点序列，外源性的两个酶切位点加入是为了后续的克隆，Myc序列的引进是为了方便后续在细胞内检测CIP的表达，可以用抗Myc的抗体。5’和3’端引物均在Invitrogen公司合成。详细见后面的序列说明。TaKaRaExTaqPCR反应试剂盒条件具体为：将以上PCR管放置在ABI9600PCR仪中进行反应，选择PCR反应条件为：变性：94℃温度5min一次(使DNA模板完成变性)，然后进行短暂变性(94℃，30秒)；在94度加热使pcDNA3.1-C-p35质粒DNA模板完全变性，或使新合成的DNA双链全部打开，以利于引物按照特异碱基互补原则与DNA模板配对。退火(56℃，15秒)；引物按照特异碱基互补原则与DNA模板配对和DNA模板自动配对，才能引导新的DNA片段合成；延伸：(72℃，30秒)；循环：25次，最后一次延长合成时间72℃为10min。PCR反应体系中的DNA聚合酶会按照DNA模板的序列在已经配对的引物后面合成相对应的DNA系列。新合成的链完全和模板DNA序列互补，形成双链DNA片段。在上述的表达神经退行性疾病保护肽的AAV9-CIP病毒的制备方法中，所述的步骤2中得到得到质粒pCR2.1-Myc-CIP具体为：将PCR产物进行DNA凝胶电泳分析，用刀片切割回收含有440bp大小的Myc-CIP目的片段，台式离心机离心，吸取含有Myc-CIP目的片段的溶液。将1体积份的Myc-CIP基因片段、1体积份的连接缓冲液、1体积份的pCR2.1载体、3体积份的水用pCR2.1-TOPO试剂盒构建pCR2.1-Myc-CIP质粒DNA，反应条件参照pCR2.1-TOPO试剂盒说明书的使用条件，质粒DNA经过常规方法转化大肠杆菌DH5a，扩增并用Sanger测序法进行序列鉴定。即取连接反应液5ul全部转化到自制的50ul感受态细菌DH5a中，冰上放置半小时后加LB细菌培养基37度水浴一小时后，取200ul细菌液铺在含有氨苄培养基的固体LB平皿上37度培养过夜，获得细菌所含的质粒序列经过Sanger测序确认。在上述的表达神经退行性疾病保护肽的AAV9-CIP病毒的制备方法中，所述的步骤3中得到质粒pEGFP-C2-Myc-CIP具体为：S31：以EcoRI和XbaI酶切pCR2.1-Myc-CIP质粒，DNA电泳、胶切割回收含有440bp大小的Myc-CIP目的片段；S32：以EcoRI和XbaI酶切pEGFP-C2质粒，DNA电泳、胶切割回收含有4.7kb大小的pEGFP-C2/EcoRI+XbaI载体片段；S33：将Myc-CIP目的片段和载体片段用T4连接酶14℃连接，得到质粒pEGFP-C2-Myc-CIPDNA。即取连接反应液5ul全部转化到自制的50ul感受态细菌DH5a中，冰上放置半小时后加LB细菌培养基37度水浴一小时后，取200ul细菌液铺在含有氨苄培养基的固体LB平皿上37度培养过夜，获得细菌所含的质粒序列经过Sanger测序确认。在上述的表达神经退行性疾病保护肽的AAV9-CIP病毒的制备方法中，所述的步骤4得到质粒pAAV-hSynapsin-GFP-Myc-CIP具体为：S41：以AgeI和HindIII酶切pEGFP-C2-Myc-CIP质粒，DNA电泳、胶切割回收含有722bp大小的EGF-Myc-CIP基因片段；pEGFP-C2-Myc-CIP质粒从美国美国宾夕法尼亚大学大学的PennVectorCore–GeneTherapyProgram公司购买。S42：以AgeI和HindIII酶切pAAV-hSynapsin-eGFP质粒，DNA电泳、胶回收刀片切割回收含有5.4kb大小的pAAV-hSynapsin载体片段S43：将回收的EGF-Myc-CIP基因片段和pAAV-hSynapsin载体片段用T4连接酶14℃连接，得到质粒pAAV-hSynapsin-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种表达神经退行性疾病保护肽的AAV9‑CIP病毒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：设计Myc‑CIP引物，以pcDNA3.1‑HisC‑p35为模板通过PCR反应得到Myc‑CIP基因片段；步骤2：将Myc‑CIP基因片段插入到pCR2.1TOPO载体中，通过连接反应得到质粒pCR2.1‑Myc‑CIP；步骤3：将Myc‑CIP基因片段以内切酶从pCR2.1‑Myc‑CIP切出并插入到pEGFP‑C2载体的多克隆位点，得到质粒pEGFP‑C2‑Myc‑CIP；步骤4：将GFP‑Myc‑CIP基因片段从质粒pEGFP‑C2‑Myc‑CIP中切出，替代pAAV‑hSynapsin‑eGFP质粒的eGFP基因片段，得到质粒pAAV‑hSynapsin‑GFP‑Myc‑CIP；步骤5：将病毒表达质粒pAAV‑hSynapsin‑GFP‑Myc‑CIP、腺相关病毒包装质粒pAAV2/9和辅助质粒pHelper共转染到人胚肾293细胞中，转染72小时后收集含有病毒的细胞及培养液，对后者进行纯化分离得到AAV9‑CIP病毒。

【技术特征摘要】
2016.08.29 CN 20161075634631.一种表达神经退行性疾病保护肽的AAV9-CIP病毒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：设计Myc-CIP引物，以pcDNA3.1-HisC-p35为模板通过PCR反应得到Myc-CIP基因片段；步骤2：将Myc-CIP基因片段插入到pCR2.1TOPO载体中，通过连接反应得到质粒pCR2.1-Myc-CIP；步骤3：将Myc-CIP基因片段以内切酶从pCR2.1-Myc-CIP切出并插入到pEGFP-C2载体的多克隆位点，得到质粒pEGFP-C2-Myc-CIP；步骤4：将GFP-Myc-CIP基因片段从质粒pEGFP-C2-Myc-CIP中切出，替代pAAV-hSynapsin-eGFP质粒的eGFP基因片段，得到质粒pAAV-hSynapsin-GFP-Myc-CIP；步骤5：将病毒表达质粒pAAV-hSynapsin-GFP-Myc-CIP、腺相关病毒包装质粒pAAV2/9和辅助质粒pHelper共转染到人胚肾293细胞中，转染72小时后收集含有病毒的细胞及培养液，对后者进行纯化分离得到AAV9-CIP病毒。2.根据权利要求1所述的表达神经退行性疾病保护肽的AAV9-CIP病毒的制备方法，其特征在于，步骤1中得到Myc-CIP基因片段的具体步骤：在PCR反应管中加入：10×ExTaqBuffer(Mg2+Plus)体积为5体积份；dNTPMixture(各2.5mM)体积为4体积份；DNA聚合酶TaKaRaExTaq(浓度为5U/μl)体积为0.5体积份；Myc-CIP-5’端引物(100uM)体积为1.5体积份；Myc-CIP-3’端引物(100uM)体积为1.5体积份；pcDNA3.1-C-p35质粒模板(100ng/ul)体积为1体积份；加水至步骤1中的体积为50体积份；按照TaKaRaExTaqPCR反应试剂盒条件进行PCR扩增，得到Myc-CIP基因片段。3.根据权利要求2所述的表达神经退行性疾病保护肽的AAV9-CIP病毒的制备方法，其特征在于，所述的步骤2中得到得到质粒pCR2.1-Myc-CIP具体为：将PCR产物进行DNA凝胶电泳分析，用刀片切割回收含有440bp大小的Myc-CIP目的片段，台式离心机离心，吸取含有Myc-CIP目的片段的溶液；将1体积份的Myc-CIP基因片段、1体积份的连接缓冲液、1体积份的pCR2.1载体、3体积份的水用pCR2.1-TOPO试剂盒构建pCR2.1-Myc-CIP质粒DNA，反应条件参照pCR2.1-TOPO试剂盒说明书的使用条件，质粒DNA经过常规方法转化大肠杆菌DH5a，扩增并用Sanger测序法进行序列鉴定。4.根据权利要求1所述的表达神经退行性疾病保护肽的AAV9-CIP病毒的制备方法，其特在于，所述的步骤3中得到质粒pEGFP-C2-Myc-CIP具体为：S31：以EcoRI和XbaI酶切pCR2.1-Myc-CIP质粒，DNA电泳、胶切割回收含有440bp大小的Myc-CIP目的片段；S32：以EcoRI和XbaI酶切pEGFP-C2质粒，DNA电泳、胶切割回收含有4.7kb大小的载体片段；S33：将Myc-CIP目的片段和载体片段用T4连接酶14℃连接，得到质粒pEGFP-C2-Myc-CIPDNA，质粒DNA经过常规方法转化大肠杆菌DH5a，扩增并用Sanger测序法进行序列鉴定。5.根据权利要求1所述的表达神经退行性疾病保护肽的AAV9-CIP病毒的制备方法，其特在于，所述的步骤4得到质粒pAAV-hSynapsin-GFP-Myc-CIP具体为：S...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡亚芳，黄建欧，潘速跃，许苗菁，贺荣霓，姬仲，周晓，何勇，宋萍萍，顾勇，谢作善，李伟，刘光辉，
申请(专利权)人：南方医科大学南方医院，
类型：发明
国别省市：广东;44