本发明专利技术涉及基因工程技术领域，视神经损伤后视网膜神经节细胞的内在再生能力低下，是视功能难以恢复的关键因素，如何有效治疗一直是临床医学面临的重大难题。本发明专利技术提供了一种携带Pim‑1基因的重组腺相关病毒2载体及其构建方法，所述的腺相关病毒2载体是携带如SEQ ID NO:1所示的Pim‑1基因的DNA序列。本发明专利技术还提供携带Pim‑1基因的重组腺相关病毒2载体在制备治疗修复受损视神经药物中的应用。本发明专利技术为临床治疗视神经损伤提供新的有力手段和理论基础，对CNS疾病和损伤的治疗也有着重要意义。
【技术实现步骤摘要】
一种携带Pim-1基因的腺相关病毒2及其在修复受损视神经中的应用
本专利技术涉及基因工程
，具体地说，是一种携带Pim-1基因的腺相关病毒2在制备治疗修复受损视神经药物中的应用。
技术介绍
中枢神经系统(CNS)疾病和损伤后，神经再生是非常困难的，如何进行有效治疗一直是临床治疗所困扰的重大难题。视神经为CNS的一部分。视神经损伤后，轴突再生困难的主要原因包括视网膜神经节细胞(RGCs)大量死亡、RGCs内在再生能力低下、引导轴突再生的细胞缺乏、抑制再生的微环境、神经营养因子的不足等。视神经损伤后RGCs的内在再生能力低下，是视神经损伤后再生失败导致视神经萎缩和失明的关键因素。目前，虽然临床上针对受损视神经的治疗开展了大量工作，但其实际疗效不佳，很难让患者恢复视力。近期关于提高RGCs内在再生能力的研究成果层出不穷：Benowitz研究组通过针刺伤晶状体，玻璃体腔内注射晶体蛋白，激活RGCs的内在再生潜力，使轴突的再生通过视神经压榨伤部位到达远段神经，但数量和生长潜能有限(参见文献[1]deLimaS,KoriyamaY,KurimotoT,etal.Fulllengthaxonregenerationintheadultmouseopticnerveandpartialrecoveryofsimplevisualbehaviors.ProcNatAcadSciUSA,2012；109(23):9149-54)。O‘Donovan等通过激活RAF-MEK通路的B-Raf，特别是联合敲除PTEN，同时有效地促进了大鼠视神经损伤后的再生(参见文献[2]O'DonovanKJ,MaK,GuoH,etal.B-RAFkinasedrivesdevelopmentalaxongrowthandpromotesaxonregenerationintheinjuredmatureCNS.JExpMed,2014；211(5):801-14)。Yungher等小鼠玻璃体注射PTEN-shRNA、CNTF的腺相关病毒2及cAMP类似物，再生轴突远达视交叉和视交叉上核并形成突触(参见文献[3]YungherBJ,LuoX,SalgueiroY,BlackmoreMG,etal.Viralvector-basedimprovementofopticnerveregeneration:characterizationofindividualaxons’growthpatternsandsynaptogenesisinavisualtarget.GeneTherapy,2015；22:811-821)。Nawabi等向PTEN敲除小鼠玻璃体注射DCLKs的腺相关病毒2，轴突再生远达视交叉(参见文献[4]NawabiH,BelinS,CartoniR,etal.Doublecortin-likekinasespromoteneuronalsurvivalandinducegrowthconereformationviadistinctmechanisms.Neuron,2015；88:704-719.)。由上可见，寻找调节再生的靶分子和基因，并将增强RGCs内在再生能力和影响再生的因素相结合，促进视神经再生，具有光明的临床前景。莫洛尼小鼠白血病病毒前病毒整合位点(provirusintegrationsiteforMoloneymurineleukemiavirus,Pim-1)为原癌基因，表达丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，属于钙-钙调蛋白调节激酶。它表达的激酶广泛存在于各组织细胞中，如胸腺、骨髓、结肠、睾丸、前列腺、心血管、大脑皮质、海马和视网膜等，Pim-1是许多细胞因子或生长因子(包括IL-2，GCSF，EGFR，HGF等)信号通路(包括JAK-STAT，AKT，MAPK，NF-kB等)的共同下游效应分子,并磷酸化特异性底物，参与细胞增殖、分化、存活等(参考文献[5]MondelloP,CuzzocreaS,MianM.Pimkinasesinhematologicalmalignancies:wherearewenowandwherearewegoing？JHematOncol,2014；7:95)。Pim-1能参与血管形成(参见文献[6]ZippoA,DeRobertisA,BardelliM,etal.IdentificationofFlk-1targetgenesinvasculogenesis:Pim-1isrequiredforendothelialandmuralcelldifferentiationinvitro.Blood,2004；103:4536-4544；参见文献[7]WalpenT,PeierM,HaasE,etal.Lossofpim1imposesahyperadhesivephenotypeonendothelialcells.CellPhysiolBiochem,2012,30(4):1083-96)、促进血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖和存活(参见文献[8]WillertM,AugsteinA,PoitzDM,etal.TranscriptionalregulationofPim-1kinaseinvascularsmoothmusclecellsanditsroleforproliferation.BasicResCardiol,2010,105(2):267-77；参见文献[9]MelocheJ,PaulinR,CourboulinA,etal.RAGE-dependentactivationoftheoncoproteinPim1playsacriticalroleinsystemicvascularremodelingprocesses.ArteriosclerThrombVascBiol,2011,31(9):2114-24；参见文献[10]ChenJ,YinH,JiangY,etal.InductionofmicroRNA-1bymyocardininsmoothmusclecellsinhibitscellproliferation.ArteriosclerThrombVascBiol,2011,31:368-375；参见文献[11]PaulinR,CourboulinA,MelocheJ,etal.Signaltransducersandactivatorsoftranscription-3/pim1axisplaysacriticalroleinthepathogenesisofhumanpulmonaryarterialhypertension.Circulation,2011,123(11):1205-15；参见文献[12]PaulinR,MelocheJ,JacobMH,etal.DehydroepiandrosteroneinhibitstheSrc/STAT3constitutiveactivationinpulmonaryarterialhypertension.AmJPhysiolHeartCircPhysiol,2011,301:H1798-本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种携带Pim‑1基因的重组腺相关病毒2载体，其特征在于，所述的腺相关病毒2载体是携带如SEQ ID NO:1所示的Pim‑1基因的DNA序列。
【技术特征摘要】
1.一种携带Pim-1基因的重组腺相关病毒2载体，其特征在于，所述的腺相关病毒2载体是携带如SEQIDNO:1所示的Pim-1基因的DNA序列。2.根据权利要求1所述的携带Pim-1基因的重组腺相关病毒2载体，其特征在于，所述的腺相关病毒2载体选用AAV三质粒系统，由AAV载体pAOV-CAGMINI-eGFP-2A-MCS-3FLAG、包装质粒pAAV-RC和辅助质粒pHelper组成；目的基因Pim-1由CAGMINI启动子启动；Pim-1基因插入载体MCS多克隆酶切位点，Pim-1的C端带3×Flag标签蛋白。3.一种如权利要求2所述的携带Pim-1基因的重组腺相关病毒2载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：A)Pim-1基因的重组腺相关病毒2载体的克隆构建设计并合成PCR引物如下：Pim-1-正向引物如SEQIDNO:2所示；Pim-1-反向引物中SEQIDNO:3所示；使用PCR方法从含有如SEQIDNO:1所示的Pim-1基因cDNA克隆模板进行Pim-1目的基因扩增；将pAOV-CAGMINI-eGFP-2A-MCS-3FLAG载体及Pim-1基因PCR产物均使用Nhel酶切载体，酶切完全后进行酶切产物的纯化，将酶切后的腺相关病毒载体和Pim-1基因PCR产物进行连接反应，通过连接反应将上述酶切片段准确连接到pAOV表达载体的NheI位点上，获得pAOV-CAGMINI-eGFP-2A-Pim-1-3FL...
【专利技术属性】
技术研发人员：许家军，张守梅，王栋，刘芳，黄婷婷，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：上海,31
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