使用人源化抗CD19嵌合抗原受体治疗癌症制造技术

本发明专利技术提供用于治疗CD19表达相关疾病的组合物和方法。本发明专利技术还涉及特异于CD19的嵌合抗原受体(CAR)、编码其的载体、和包含CD19CAR的重组T细胞。本发明专利技术还包括施用遗传修饰的T细胞的方法，其中所述T细胞表达包含CD19结合结构域的CAR。构域的CAR。

【技术实现步骤摘要】
使用人源化抗CD19嵌合抗原受体治疗癌症
[0001]本申请是申请日为2014年3月15日的、专利技术名称为“使用人源化抗CD19嵌合抗原受体治疗癌症”的中国专利申请201480027401.4(PCT/US2014/029943)的分案申请。
[0002]本申请要求2013年3月16日递交的美国系列号61/802,629和2013年6月24日递交的美国系列号61/838,537的优先权，这些美国申请的全部内容均并入此处作为参考。
[0003]序列表
[0004]本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式电子提交，特此将其全部内容并入作为参考。所述ASCII拷贝创建于2014年3月14日，命名为N2067
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7002WO_SL.txt，228,415字节大小。
专利

[0005]本专利技术一般地涉及，经工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞在治疗分化群19蛋白(the Cluster of Differentiation 19 protein,CD19)表达相关疾病中的用途。

技术介绍

[0006]许多B细胞恶性病患者不能使用标准疗法治愈。此外，传统治疗选项常常有严重副作用。在癌症免疫治疗中已经进行过尝试，但是几种障碍使得十分难于获得临床有效性。尽管已经鉴定了数百种所谓的肿瘤抗原，但是这些抗原通常来源于自身并因此免疫原性弱。此外，肿瘤可以通过几种机制来抵抗免疫攻击的起始和扩大。
[0007]在使用嵌合抗原受体(CAR)修饰的自体T细胞(CART)疗法上的近来进展，在利用免疫系统力量治疗B细胞恶性病和其它癌症方面显示出希望，其中所述CART疗法依赖于将T细胞重新定向于癌细胞例如B细胞恶性病上的合适细胞表面分子(参见,例如，Sadelain et al.,Cancer Discovery 3:388
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398(2013))。鼠源CART19(即“CTL019”)的临床结果已经表现出有希望在罹患CLL的患者和儿童ALL中建立完全缓解(参见例如，Kalos et al.,Sci Transl Med 3:95ra73(2011),Porter et al.,NEJM 365:725
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733(2011),Grupp et al.,NEJM 368:1509
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1518(2013))。除了在遗传修饰T细胞上的嵌合抗原受体能够识别和破坏所靶向的细胞外，成功的治疗性T细胞疗法还需要具有增殖和长时间维持的能力、以及监控白血病细胞逃逸的能力。T细胞的变异性质(无论这是无能(anergy)、抑制或是耗竭的结果)对CAR转化的T细胞的性能产生影响，而对此影响，本领域技术人员在目前可以施予的控制是有限的。为了有效，CAR转化的患者T细胞需要持续存在和维持响应于CAR抗原而增殖的能力。已经证实，使用包含鼠scFv的CART19，ALL患者T细胞可以实现此目的(参见例如，Grupp et al.,NEJM 368:1509
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1518(2013))。
[0008]专利技术概述
[0009]本专利技术通过提供整合在嵌合抗原受体(CAR)构建体中的、优化的和人源化的抗体片段(例如scFv)在患者中实现了免疫反应控制，其中所述抗体片段结合分化群19蛋白(CD19),其中所述CAR构建体在患者中不引起免疫反应，可以安全地长期使用，并且与治疗B细胞来源癌症的已知CART疗法相比，可以维持或获得更好的临床有效性。本专利技术还涉及，使
用T细胞治疗CD19(OMIM Acc.No.107265,Swiss Prot.Acc No.P15391)表达相关血液学癌症的用途，其中所述T细胞经工程化表达整合在CAR中的、结合CD19的人源化抗体片段。
[0010]因此，一方面，本专利技术涉及编码嵌合抗原受体(CAR)的分离核酸分子，其中该CRA包含：包括人源化抗CD19结合结构域的抗体或抗体片段、跨膜结构域、和胞内信号传导结构域(例如,包含共刺激结构域和/或第一信号传导结构域(primary signaling domain)的胞内信号传导结构域)。在一个实施方案中，CAR包含：包括本文所述人源化抗CD19结合结构域的抗体或抗体片段、本文所述跨膜结构域、和本文所述胞内信号传导结构域(例如，包含共刺激结构域和/或第一信号传导结构域的胞内信号传导结构域)。
[0011]在一个实施方案中，编码的人源化抗CD19结合结构域包含本文所述人源化抗CD19结合结构域的轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)之一个或多个(例如所有三个)、和/或本文所述人源化抗CD19结合结构域的重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)之一个或多个(例如所有三个)，例如，包含一个或多个(如所有三个)LC CDR和一个或多个(如所有三个)HC CDR的人源化抗CD19结合结构域。一个实施方案中，人源化抗CD19结合结构域包含至少HC CDR2。在一个实施方案中，编码的人源化抗CD19结合结构域包含本文所述人源化抗CD19结合结构域的重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)之一个或多个(例如所有三个)，例如，编码的人源化抗CD19结合结构域具有两个可变重链区，两个区均包含本文所述HC CDR1,HC CDR2和HC CDR3。一个实施方案中，人源化抗CD19结合结构域包含至少HC CDR2。一个实施方案中，编码的轻链可变区包含VK3_L25种系序列的一、二、三或所有四个构架区。一个实施方案中，编码的轻链可变区具有修饰(例如，替代，例如存在于SEQ ID NO:58的轻链可变区的相应位置上的一个或多个氨基酸的替代，例如在位置71和87的一个或多个上的替代)。一个实施方案中，编码的重链可变区包含VH4_4
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59种系序列的一、二、三或所有四个构架区。一个实施方案中，编码的重链可变区具有修饰(例如，替代，例如存在于SEQ ID NO:58的重链可变区的相应位置上的一个或多个氨基酸的替代，例如位置71、73和78的一个或多个上的替代)。在一个实施方案中，编码的人源化抗CD19结合结构域包含本文(例如表3)所述人源化轻链可变区和/或本文(例如表3)所述人源化重链可变区。在一个实施方案中，编码的人源化抗CD19结合结构域包含本文(例如表3)所述人源化重链可变区，例如至少两个本文(例如表3)所述人源化重链可变区。在一个实施方案中，编码的抗CD19结合结构域是包含表3的氨基酸序列的轻链和重链的scFv。一个实施方案中，抗CD19结合结构域(例如scFv)包含:轻链可变区，其包含在表3所示轻链可变区的氨基酸序列上具有至少一个、两个或三个修饰(例如替代)但不超过30个、20个或10个修饰(例如替代)的氨基酸序列、或与表3的氨基酸序列具有95
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99％同一性的序列；和/或重链可本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.编码嵌合抗原受体(CAR)的分离核酸分子，其中该CAR包含包括人源化抗CD19结合结构域的抗体或抗体片段、跨膜结构域、和包含刺激结构域的胞内信号传导结构域，其中所述抗CD19结合结构域包含表3所列任何抗CD19轻链结合结构域氨基酸序列的轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)之一个或多个、以及表3所列任何抗CD19重链结合结构域氨基酸序列的重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)之一个或多个。2.权利要求1的分离核酸分子，包含表3所列任何抗CD19轻链结合结构域氨基酸序列的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3。3.权利要求1的分离核酸分子，包含表3所列任何抗CD19轻链结合结构域氨基酸序列的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3。4.权利要求1的分离核酸分子，包含表3所列任何抗CD19轻链结合结构域氨基酸序列的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，以及表3所列任何抗CD19重链结合结构域氨基酸序列的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3。5.权利要求1的分离核酸分子，包含表3所列任何轻链可变区。6.权利要求1的分离核酸分子，包含表3所列任何重链可变区。7.权利要求1的分离核酸分子，包含表3所列任何轻链可变区和表3所列任何重链可变区。8.任何前述权利要求的分离核酸分子，其中CD19结合结构域是scFv。9.任何前述权利要求的分离核酸分子，其中轻链可变区包含在表3所示轻链可变区的氨基酸序列中具有至少一个、两个或三个修饰但不超过30个、20个或10个修饰的氨基酸序列、或与表3所示氨基酸序列具有95
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99％同一性的序列。10.任何前述权利要求的分离核酸分子，其中重链可变区包含在表3所示重链可变区的氨基酸序列中具有至少一个、两个或三个修饰但不超过30个、20个或10个修饰的氨基酸序列、或与表3所示氨基酸序列具有95
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99％同一性的序列。11.任何前述权利要求的分离核酸分子，其中抗CD19结合结构域包含选自SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,和SEQ ID NO:12的序列、或与其具有95
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99％同一性的序列。12.任何前述权利要求的分离核酸分子，其中编码抗CD19结合结构域的核酸序列包含选自SEQ ID NO:61,SEQ ID NO:62,SEQ ID NO:63,SEQ ID NO:64,SEQ ID NO:65,SEQ ID NO:66,SEQ ID NO:67,SEQ ID NO:68,SEQ ID NO:70,SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:72的序列、或与其具有95
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99％同一性的序列。13.任何前述权利要求的分离核酸分子，其中编码的CAR包括跨膜结构域，所述跨膜结构域包含选自以下的蛋白的跨膜结构域：T细胞受体的α,β或ζ链,CD28,CD3ε,CD45,CD4,CD5,CD8,CD9,CD16,CD22,CD33,CD37,CD64,CD80,CD86,CD134,CD137和CD154。14.任何前述权利要求的分离核酸分子，其中编码的跨膜结构域包含SEQ ID NO:15的序列。15.任何前述权利要求的分离核酸分子，其中编码的跨膜结构域包含在SEQ ID NO:15的氨基酸序列中具有至少一个、两个或三个修饰但不超过20个、10个或5个修饰的氨基酸序
列、或与SEQ ID NO:15的氨基酸序列具有95
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99％同一性的序列。16.任何前述权利要求的分离核酸分子，其中编码跨膜结构域的核酸序列包含SEQ ID NO:15的序列、或与其具有95
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99％同一性的序列。17.任何前述权利要求的分离核酸分子，其中编码的抗CD19结合结构域通过铰链区与跨膜结构域连接。18.权利要求17的分离核酸分子，其中编码的铰链区包含SEQ ID NO:14、或与其具有95
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99％同一性的序列。19.权利要求17的分离核酸分子，其中编码铰链区的核酸序列包含SEQ ID NO:55的序列、或与其具有95
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99％同一性的序列。20.任何前述权利要求的分离核酸分子，还包含编码共刺激结构域的序列。21.权利要求20的分离核酸分子，其中共刺激结构域是从选自以下的蛋白获得的功能性信号传导结构域：OX40,CD2,CD27,CD28,CDS,ICAM
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1,LFA
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1(CD11a/CD18),ICOS(CD278),和4
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1BB(CD137)。22.权利要求20或21的分离核酸分子，其中编码的共刺激结构域包含SEQ ID NO:16的序列。23.权利要求20或21的分离核酸分子，其中编码的共刺激结构域包含在SEQ ID NO:16的氨基酸序列中具有至少一个、两个或三个修饰但不超过20个、10个或5个修饰的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有95
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99％同一性的序列。24.权利要求20或21的分离核酸分子，其中编码共刺激结构域的核酸序列包含SEQ ID NO:60的序列、或与其具有95
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99％同一性的序列。25.任何前述权利要求的分离核酸分子，还包含编码胞内信号传导结构域的序列。26.任何前述权利要求的分离核酸分子，其中编码的胞内信号传导结构域包含4
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1BB的功能性信号传导结构域和/或CD3ζ的功能性信号传导结构域。27.任何前述权利要求的分离核酸分子，其中编码的胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:16的序列和/或SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:43的序列。28.任何前述权利要求的分离核酸分子，其中胞内信号传导结构域包含在SEQ ID NO:16的氨基酸序列和/或SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:43的氨基酸序列上具有至少一个、两个或三个修饰但不超过20个、10个或5个修饰的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:16的氨基酸序列和/或SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:43的氨基酸序列具有95
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99％同一性的序列。29.任何前述权利要求的分离核酸分子，其中编码的胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:16的序列和SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:43的序列,其中包含胞内信号传导结构域的这些序列在相同读框中作为单一多肽链表达。30.任何前述权利要求的分离核酸分子，其中编码胞内信号传导结构域的核酸序列包含SEQ ID NO:60的序列或与其具有95
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99％同一性的序列、和/或SEQ ID NO:101或SEQ ID NO:44的序列或与其具有95
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99％同一性的序列。31.任何前述权利要求的分离核酸分子，还包含前导序列。32.权利要求31的分离核酸分子，其中前导序列包含SEQ ID NO:13。33.由权利要求1
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32之任一项的核酸分子编码的分离的多肽分子。34.权利要求33的分离的多肽，其包含选自SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:
33,SEQ ID NO:34,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:36,SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:39,SEQ ID NO:40,SEQ ID NO:41,和SEQ ID NO:42的序列。35.权利要求34的分离的多肽，包含SEQ ID NO：31的序列。36.权利要求34的分离的多肽，包含SEQ ID NO：32的序列。37.权利要求34的分离的多肽，包含SEQ ID NO：35的序列。38.权利要求34的分离的多肽，包含SEQ ID NO：36的序列。39.权利要求34的分离的多肽，包含SEQ ID NO：37的序列。40.分离的嵌合抗原受体(CAR)分子，其包含人源化抗CD19结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域。41.权利要求40的分离CAR分子，其包含包括人源化抗CD19结合结构域的抗体或抗体片段、跨膜结构域和胞内信号传导结构域。42.权利要求40或41的分离CAR分子，其中人源化抗CD19结合结构域包含表3所列任何人源化抗CD19结合结构域的轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)之一个或多个、以及表3所列任何人源化抗CD19结合结构域的重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)之一个或多个。43.权利要求40
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42之任一项的分离CAR分子，包含表3所列任何抗CD19轻链结合结构域氨基酸序列的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3。44.权利要求40
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43之任一项的分离CAR分子，包含表3所列任何抗CD19重链结合结构域氨基酸序列的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3。45.权利要求40
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44之任一项的分离CAR分子，包含表3所列任何抗CD19轻链结合结构域氨基酸序列的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，以及表3所列任何抗CD19重链结合结构域氨基酸序列的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3。46.权利要求40
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45之任一项的分离CAR分子，其中抗CD19结合结构域是scFv。47.权利要求40
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46之任一项的分离CAR分子，其中抗CD19结合结构域包含表3所列氨基酸序列的轻链和重链。48.权利要求40
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47之任一项的分离CAR分子，其中抗CD19结合结构域包含：轻链可变区，其包含在表3所示轻链可变区的氨基酸序列中具有至少一个、两个或三个修饰但不超过30个、20个或10个修饰的氨基酸序列、或与表3所示氨基酸序列具有95
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99％同一性的序列。49.权利要求40
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48之任一项的分离CAR分子，其中抗CD19结合结构域包含重链可变区，所述重链可变区包含在表3所示重链可变区的氨基酸序列中具有至少一个、两个或三个修饰但不超过30个、20个或10个修饰的氨基酸序列、或与表3所示氨基酸序列具有95
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99％同一性的序列。50.权利要求40
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49之任一项的分离CAR分子，其中抗CD19结合结构域包含选自SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的序列、或与其具有95
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99％同一性的序列。51.权利要求40
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50之任一项的分离CAR分子，还包含选自以下的蛋白的跨膜结构域：T细胞受体的α,β或ζ链,CD28,CD3ε,CD45,CD4,CD5,CD8,CD9,CD16,CD22,CD33,CD37,CD64,
CD80,CD86,CD134,CD137和CD154。52.权利要求51的分离CAR分子，其中跨膜结构域包含SEQ ID NO:15的序列。53.权利要求51或52的分离核酸分子，其中跨膜结构域包含在SEQ ID NO:15的氨基酸序列中具有至...

【专利技术属性】
技术研发人员：J，
申请(专利权)人：宾夕法尼亚大学托管会，
类型：发明
国别省市：