本发明专利技术涉及一种用于以LAMP法检测炭疽杆菌的引物、双重LAMP检测炭疽杆菌的试剂盒、双重LAMP检测炭疽杆菌的快速可视化检测方法、以及针对该试剂盒的检验方法。该引物包括lef引物序列集和gyrB引物序列集，既可以检测炭疽杆菌质粒pX01，又可以检测炭疽杆菌染色体。该试剂盒包括前述引物，可获得准确的检测结果。该检测方法采用前述试剂盒进行，可不用开盖即实现可视化检测，避免出现假阳性现象，无需使用昂贵的实时浊度仪。该检验方法可确保使用正常的试剂盒来得到可靠的结果。本发明专利技术结果可靠，成本相对较低，尤其适用于条件简陋的卫生事件现场。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种用于以LAMP法检测炭疽杆菌的引物、含有该引物的试剂盒、采用该试剂盒的检测方法、以及针对该试剂盒的检验方法，属于生物
技术介绍
炭疽杆菌是人畜共患致病菌，可通过皮肤接触、呼吸道及消化道感染人和动物，具有高度致病性，其中肺炭疽被列为中国国家法定甲类传染病(最高级别)。炭疽杆菌可通过空气飞沫传播，可形成气溶胶，易引发突发公共卫生事件；而炭疽杆菌芽孢可存活十年以上，可构成公共卫生隐患。炭疽杆菌严重威胁人类健康和生命安全，其检测和预防一直倍受 重视。然而，目前的检测方法面临两个主要问题一是如何在条件较简陋的事发现场快速确定是否存在炭疽杆菌；二是如何快速诊断出炭疽强毒株，以挽救吸入性感染炭疽强毒株的病人生命，同时确定针对目标人群的强制性隔离防疫措施等。传统炭疽杆菌的检测诊断都是基于形态学特征或表型特征，如革兰氏阳性染色试验、噬菌体试验、串珠和青霉素抑制试验、拉丝试验〈粘型菌落〉、溶血试验、芽孢形成试验等，这些方法在一定程度上都存在着费时、操作繁琐、灵敏度低等缺点，均不适合早期快速侦检。现有技术中，免疫胶体金技术、常规PCR及DNA探针杂交技术，均存在特异性和敏感性的问题；实时荧光定量PCR技术灵敏度高，可靠性好，是全封闭反应，但是该技术需要价格昂贵的荧光定量PCR仪，无法在很多中小医院和基层防疫机构普及，且为了保证高特异性往往需要荧光标记探针，检测成本较高。此外，精密贵重仪器对质量控制、操作环境和人员的专业能力要求较高，难以在疫情现场使用。2000年，日本学者Notomi等开发出一种新技术——LAMP法(环介导等温扩增法)，扩增反应全过程均在同一温度下进行，不须像PCR反应那样需要经历几十个温度变化的循环过程，因此对扩增所需仪器的要求大大简化，仅需水浴锅或其它小型恒温加热器即可，并且反应时间缩短。LAMP法的基本原理是针对靶基因的6个区域设计4飞条引物(包括2条内引物和2条外引物，可另加2条非必需的环引物)，在具有链置换特性的Bst DNA聚合酶作用下，外引物的延伸产物将内引物的延伸产物置换出来，形成一个哑铃状的DNA，然后进入循环扩增阶段，最终形成茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段混合物。LAMP法具有以下优点(I)较高特异性和抗干扰能力，只有当2对引物与目的片段的6个区域都匹配上时才能进行扩增；(2)反应体系稳定可靠，在室温下放置2周后仍然稳定，并且对于样品中原有或污染的无关、干扰片段仍然不敏感，而其他类似技术则无法做到这一点；(3)敏感性较高，扩增快速、高效，I小时内产物量可达约IOltl倍，约为普通PCR的1000倍。因此，LAMP法为病原微生物的核酸检测提供了一个更简便、更快速、更有效的手段，尤其适用于疫情现场、野外工作、基层单位等条件相对简陋的环境。但是，目前应用于病原体检测的LAMP法，几乎都存在一个关键问题LAMP扩增产物的检测手段主要是扩增结束后开盖加入荧光染料SYBR Green I等显色液，但在此过程中，很难避免核酸气溶胶污染所致的后续假阳性结果。出现假阳性的主要原因是由于扩增结束后核酸片段产物量过于巨大，往往又是同一片段的重复序列，加热后会形成气溶胶，开盖后即挥散在空气、尘埃中以及器皿、衣物、工作台和耗材试剂等表面，而LAMP方法又过于灵敏，气溶胶污染后将造成后续检测的高假阳性率。日本荣研公司的LA-320实时浊度仪专用于LAMP法，可实时监测浊度变化，无需开盖，可避免前述假阳性现象，但该仪器价格昂贵约60万元，限制了其推广应用。此外，值得注意的是，现有利用某单一基因鉴定炭疽杆菌的方法并不完全可靠炭疽杆菌与枯草芽孢杆菌等其它蜡样菌群有很高的同源性，重要区别在于炭疽杆菌含有2个与毒力密切相关的特异性质粒(pXOl和pX02) ;pX01质粒上包含分别编码致死因子、保护性抗原、水肿因子的lef、PA和cya基因，pX02质粒上则包含与芽孢形成有关的基因如 capA、capB、capC基因。目前已有的炭疽杆菌核酸检测方法基本上都会检测这些质粒上的特异致病因子，但是炭疽杆菌的质粒并不稳定，容易缺失而使炭疽杆菌成为弱毒株或无毒株，而且自然环境下这些质粒可被导入其它菌株，即在普通蜡状芽胞杆菌群间水平转移。相较之下，炭疽杆菌的染色体表达相对稳定，可在准确鉴定中发挥重要作用。经检索发现，申请号201110044466. 8、公布号为CN102146470A的中国专利技术专利申请提供一种炭疽芽孢杆菌检测试剂盒及其使用方法，包括以炭疽芽孢杆菌PA基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的两对引物内引物FIP/BIP和外引物F3/B3。但是，该试剂盒仅能检测到核酸来源是否含有炭疽杆菌质粒PX01，也就是说，有可能会误检到含有毒性质粒PXOl的蜡状芽胞杆菌。此外，该专利为了避免气溶胶污染，必须使用特制反应管，但这样一来，使用者必须额外购买这种反应管，增加使用成本，很不方便。
技术实现思路
本专利技术的第一目的是针对现有技术存在的问题，提供一种用于以LAMP法检测炭疽杆菌的引物，可用于确证是否存在炭疽杆菌。本专利技术的第二目的是提供含有上述引物的试剂盒，可确证是否存在炭疽杆菌。本专利技术的第三目的是提供采用前述试剂盒的检测方法，可不用开盖即实现可视化检测，避免出现假阳性现象，无需使用昂贵的实时浊度仪。本专利技术的第四目的是提供针对前述试剂盒的检验方法，确保使用正常的试剂盒来得到可靠的结果。申请人:经研究发现炭疽杆菌染色体中的gyrB基因高度保守，若作为鉴定目标，则可确保炭疽杆菌鉴定的准确性；与PA基因相比，炭疽杆菌质粒pXOl上编码致死因子的Ief基因与炭疽杆菌致病性的关联度更高，更具有代表性，更适宜作为鉴定目标。通常认为，在扩增前就将显色剂加入反应体系应能避免扩增后开盖导致的气溶胶污染，然而实际研究表明，采用现有反应体系时，扩增前加入显色剂会导致显色剂不稳定、失效或严重抑制扩增反应进行，无法进行检测。申请人经反复深入地实验研究后，终于得出在扩增前加入显色剂仍能正常检测的炭疽杆菌核酸恒温扩增反应体系，反应结束时即显示出结果且重复性良好，不存在扩增后开盖操作，从而彻底解决了气溶胶污染问题。同时，该反应体系使用普通反应管即可实现，非常方便。结合上述发现，实现本专利技术第一目的的技术方案如下一种用于LAMP检测炭疽杆菌的引物，其特征是，包括Ief引物序列集和gyrB引物序列集；其中，Ief引物序列集包括外引物对LF-F3和LF-B3，以及内引物对LF-FIP和LF-BIP ；LF-F3的序列如SEQ ID NO: I所示，LF-B3的序列如SEQ ID NO: 2所示，LF-FIP的序列如SEQ ID NO:3 所示，LF-BIP 的序列如 SEQ ID NO:4 所示；gyrB引物序列集包括外引物对gy_F3和gy_B3,内引物对gy-FIP和gy-BIP,以及环引物对gy-LF和gy-LB ;gy-F3的序列如SEQ ID NO: 5所示，gy_B3的序列如SEQ ID NO: 6所示，gy-FIP的序列如SEQ ID NO: 7所示,gy-BIP的序列如SEQ ID NO: 8所示,gy-LF的序列如SEQ ID NO:9所示，gy-LB的序列如SEQ ID NO: 10所示。采用该引物后，既检本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于LAMP检测炭疽杆菌的引物，其特征是，包括lef引物序列集和gyrB引物序列集；其中，lef引物序列集包括外引物对LF？F3和LF？B3，以及内引物对LF？FIP和LF？BIP；LF？F3的序列如SEQ？ID？NO:1所示，LF？B3的序列如SEQ？ID？NO:2所示，LF？FIP的序列如SEQ？ID？NO:3所示，LF？BIP的序列如SEQ？ID？NO:4所示；gyrB引物序列集包括外引物对gy？F3和gy？B3，内引物对gy？FIP和gy？BIP，以及环引物对gy？LF和gy？LB；gy？F3的序列如SEQ？ID？NO:5所示，gy？B3的序列如SEQ？ID？NO:6所示，gy？FIP的序列如SEQ？ID？NO:7所示，gy？BIP的序列如SEQ？ID？NO:8所示，gy？LF的序列如SEQ？ID？NO:9所示，gy？LB的序列如SEQ？ID？NO:10所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张锦海，王长军，谭维国，吕恒，曹勇平，
申请(专利权)人：中国人民解放军南京军区军事医学研究所，
类型：发明
国别省市：
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