本发明专利技术公开了一种副溶血性弧菌多重PCR-DHPLC检测引物、试剂盒和检测方法。所述的检测引物如SEQ?ID?NO.1、2、3、4、5和6所示，按照本发明专利技术的MPCR-DHPLC检测方法检测，在一次扩增反应中完成对待测样品的副溶血性弧菌的特异性检测和毒力基因检测，从而简便、快速、准确的对待检样品中是否含有副溶血性弧菌以及该副溶血性弧菌是否含有毒力基因进行判断。以本发明专利技术的检测引物和检测试剂盒，按照本发明专利技术的检测方法对样品进行MPCR-DHPLC检测，检测快速、可靠、灵敏度高、特异性强。因此本发明专利技术适用于食品以及海产品等检验检疫，尤其是对进出口食品及海产品，可供检验检疫局、疾病预防控制中心和质量监督部门对样品进行简便、快速、准确的检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程
，具体涉及重要的食源性病原菌副溶血性弧菌(Vibrio ParahemoIyticus)的多重PCR-DHPLC检测引物、试剂盒和检测方法,适合于进出口食品检验、疾病控制中心、质量监督部门使用。
技术介绍
副溶血弧菌(Vibrio Parahaemolyticus)是 一种革兰氏阴性嗜盐杆菌,是沿海国家的重要食物中毒致病菌之一，可导致患者腹泻、肠痉挛、恶心、呕吐、发烧等典型胃肠炎反应。副溶血性弧菌主要存在于海水及海产品中，在日本由该菌引起的食物中毒占细菌性食物中毒的40%飞0%，位居首位。另外，美国、澳大利亚、英国、比利时、法国、韩国和东南亚地区，都有该菌引起食物中毒爆发的报告。我国从1998年以来的资料显示，副溶血弧菌引发的食物中毒的发生规模及人群暴露规模呈明显上升趋势，均已超过沙门氏菌食物中毒，跃居细菌性中毒的首位。副溶血性弧菌传统的检测方法是基于形态特征、染色特征、生化特征、血清分型等表型特征来鉴定。这些常规的方法在副溶血性弧菌研究工作中起到了重要作用，但现代科学技术的发展，传统的依靠表型特征来鉴定副溶血性弧菌的方法，已远远不能满足对该菌的快速诊断以及流行病学研究的需要，暴露出许多不足之处操作繁琐，鉴定周期长，不利于急性中毒的快速诊断和口岸快速通关的要求；副溶血性弧菌的致病机理复杂且多样化，不含毒力因子的菌株不一定致病，而传统的培养鉴定法短时间内无法确定该菌的毒力强弱，还需继续增加其他特殊的生化等鉴定实验，这无疑使鉴定周期更加漫长。因此，迫切急需研究出能够更加快速、准确无误、检测通量更高、人为影响因素尽可能减少，而且能获得分离的病原体基因型别、毒力基因分布等多重信息的检测方法。变性高效液相色谱分析(DenaturingHigh-Performance LiquidChromatography, DHPLC)是近年来建立并得以迅速发展的新技术,广泛应用于单核苷酸多态性和突变分析、甲基化分析、DNA片段长度分析等多个领域。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种快速、可靠、灵敏度高、特异性强的副溶血性弧菌多重PCR-D HPLC检测引物、试剂盒和检测方法，通过一次反应就能完成对副溶血性弧菌的特异性检测和毒力基因检测。本专利技术以副溶血性弧菌(VP)的toxR、tdh、trh为目的基因，用MPCR-DHPLC特异性检测VP同时检测其tdh、trh毒力基因，从而鉴别副溶血性弧菌(VP)及其毒力基因，实现了本专利技术的目的。本专利技术的副溶血性弧菌多重PCR-DHPLC检测引物，其特征在于，所述的检测引物如下所示针对tdh 基因tdh F5’ -gcaccggtcaatgtagaggt-3’，(如 SEQ ID NO. I 所不)Tdh R5，-cagcagaatgaccgtgctta-3，；(如 SEQ ID NO. 2 所不)针对trh 基因trh F5，-aactgaatccccggttaagg-3’ ,(如 SEQ ID NO. 3 所不)Trh R5，-atatgtccattgccgctctc-3’ ；(如 SEQ ID NO. 4 所不)针对toxR 基因toxR F5' -tgatttgcgggtgatttaca-3’ ,(如 SEQ ID NO. 5 所不)toxR R5，-ccgtctttagcgacgacttc-3，。(如 SEQ ID NO. 6 所不)本专利技术的副溶血性弧菌多重PCR-DHPLC检测试剂盒，包括MPCR反应液、检测引物和DHPLC反应试剂，其特征在于，所述的检测引物如下所示针对tdh 基因tdh F5’ -gcaccggtcaatgtagaggt-3 ,(如 SEQ ID NO. I 所不)tdh R5，-cagcagaatgaccgtgctta-3，；(如 SEQ ID NO. 2 所不)针对trh 基因trh F5’ _aactgaatccccggttaagg_3’ ,(如 SEQ ID NO. 3 所不)trh R5，-atatgtccattgccgctctc-3’ ；(如 SEQ ID NO. 4 所不)针对toxR 基因toxR F5' -tgatttgcgggtgatttaca-3’ ,(如 SEQ ID NO. 5 所不)toxR R5' -ccgtctttagcgacgacttc-3' (如 SEQ ID NO. 6 所不)本专利技术的非诊断目的的副溶血性弧菌多重PCR-DHPLC检测方法，其特征在于，包括以下步骤(I)对样品进行增菌培养，提取增菌液中菌体的基因组DNA作为模板；(2)使用上述针对tdh基因、trh基因和toxR基因的检测引物，与MPCR反应液混合形成扩增反应体系，进行MPCR反应，反应结束后，将PCR反应产物进行DHPLC分析，根据DHPLC分析结果判断是否含有副溶血性弧菌以及其毒力基因分型。所述的扩增反应体系优选为50μ I的体系，包括10XBuffer6y 1，dNTPs5y 1，针对tdh和toxR基因的上下游引物各I μ 1，针对trh基因的上下游引物各3 μ 1，Taq酶IU/μ 10. 5 μ 1，双蒸水 26. 5μ 1，模板 DNA2y I。所述的进行MPCR反应吗，优选为，其循环参数为95°C 30s、94°C 30s、55°C 30s、72°C Imin进行30个循环，72°C延伸IOmin0所述的进行DHPLC分析具体是取5 μ L PCR产物进行DHPLC分析，选择非变性-双链DNA多片段分离模式，柱温50°C，流动相为缓冲溶液A体积分数为50. 2%，缓冲溶液B体积分数为49. 8%，流速0. 9ml/min ;所述的缓冲溶液A为0. lmol/L TEAA水溶液、缓冲溶液B为0. lmol/LTEAA含体积分数25%的乙腈水溶液。本专利技术以toxR基因作为副溶血性弧菌特异性检测的靶基因，以tdh基因和trh基因作为是否致病性的毒力检测基因，设计检测引物，按照本专利技术的MPCR-DHPLC检测方法检测，在一次扩增反应中完成对待测样品的副溶血性弧菌的特异性检测和毒力基因检测，从而简便、快速、准确的对待检样品中是否含有副溶血性弧菌以及该副溶血性弧菌是否含有毒力基因进行判断。以本专利技术的检测引物和检测试剂盒，按照本专利技术的检测方法对样品进行MPCR-DHPLC检测，检测快速、可靠、灵敏度高、特异性强。因此本专利技术适用于食品以及海广品等检验检疫，尤其是对进出口食品及海广品，可供检验检疫局、疾病预防控制中心和质量监督部门对样品进行简便、快速、准确的检测。附图说明图I 是 VP40 菌株的 TDH、TOXR 和 TRH3 重 PCR 的 DHPLC 图；图2是VP40菌株的TDH、T0XR和TRH3重PCR产物的电泳图，其中M :50bp Marker ；I :TDH、TOXR和TRH的3重PCR扩增产物；2 =TDH的扩增产物，196bp ；3 =ToxR的扩增产物，234bp ；4 =TRH 的扩增产物，363bp ；图3是检测引物灵敏度的DHPLC图，从上到下为VPL4_91菌株的KT1稀释度；10_2稀释度；IO-3稀释度；IO-4稀释度；IO-5稀释度；IO-6稀释度；图4是检测引物灵敏度的电泳图本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种副溶血性弧菌多重PCR？DHPLC检测引物，其特征在于，所述的检测引物如下所示：针对tdh基因：tdh？F5’？gcaccggtcaatgtagaggt？3’，Tdh？R5’？cagcagaatgaccgtgctta？3’；针对trh基因：trh？F5’？aactgaatccccggttaagg？3’,Trh？R5’？atatgtccattgccgctctc？3’；针对toxR基因：toxR？F5“？tgatttgcgggtgatttaca？3“，toxR？R5“？ccgtctttagcgacgacttc？3“。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：许龙岩，凌莉，焦红，
申请(专利权)人：广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：
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