本发明专利技术公开了一种黄牛FBXO32(F-boxprotein?32)基因单核苷酸多态性及作为分子标记的检测方法。以包含FBXO32基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P(P1、P2、P3)为引物，PCR扩增黄牛FBXO32基因；用限制性内切酶HaeIII、HaeIII、BfaI分别消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛FBXO32基因(NCBI参考序列号：NC_007312.4)第22830位、第44675位、第53423位的单核苷酸多态性。本发明专利技术提供的检测方法为FBXO32基因的单核苷酸多态性与生长性状关系的建立奠定了基础，以便用于中国黄牛肉用生长性状的标记辅助选择(MAS)，快速建立遗传资源优良的黄牛种群。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子遗传学领域，涉及基因单核苷酸多态性(SNP)的检测，特别涉及一种检测黄牛FBX032基因单核苷酸多态性的方法。
技术介绍
单核苷酸多态性(SNP)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP既有可能在基因序列内，也有可能在基因以外的非编码序列上。总的来说，位于编码区内的SNP(coding SNP,cSNP)比较少，因为在外显子内，其变异率仅及周围序列的1/5。但它在遗传性疾病研究中却具有重要意义，因此cSNP的研究更受关注。然而随着科学的发展，很多研究表明位于基因内含子中的SNP会影响基因的转录效率从而间接 的影响基因的功能，所以内含子的多态性也引起了关注。单核苷酸多态性是研究人类家族和动植物品系遗传变异的重要依据。近年来，人们发展了许多用于探寻分子遗传标记的方法，最常见的有单链构象多态技术(SSCP)、直接测序技术和PCR-RFLP等，但SSCP操作繁琐、耗时长，结果易造成误判；而直接测序技术成本又较高。因此，把构建DNA池进行测序和PCR-RFLP结合在一起的方法是一种检测SNP的有效技术，在发现SNP位点后使用限制性内切酶进行切割，然后进行琼脂糖凝胶电泳分析，就能准确地鉴别SNP位点。PCR-RFLP方法不仅具有DNA测序法的准确性，又克服了 SSCP费用昂贵、繁琐操作、假阳性率高的缺点，而且所检测的序列位点无特殊性要求。FBX032蛋白是F-box蛋白家族的成员，是泛素蛋白连接酶复合体组成之一。目前，对于FBX032基因的研究多在人类和小鼠上，主要在肌肉的代谢过程以及相关疾病发生机理等方面做了大量研究。国内外尚未见关于牛FBX032基因遗传变异的研究。中国黄牛FBX032基因遗传变异领域的研究匮乏，该基因位点的功能研究及其遗传变异与经济性状(如体斜长和日增重等性状)关联的研究仍是空白。由于FBX032基因功能涉及日增重等生长性状，本专利技术提供的检测方法为FBX032基因的SNP与生长性状关系的建立奠定了基础，以便用于中国黄牛生长性状的标记辅助选择(MAS)，快速建立遗传资源优良的黄牛种群。
技术实现思路
本专利技术解决的问题在于利用PCR-RFLP和ACRS-PCR-RFLP方法检测黄牛FBX032基因的多态性，并将其与生长性状进行关联分析，验证其是否可以作为黄牛分子育种中辅助选择的分子标记，从而加快良种选育速度。本专利技术是通过以下技术方案来实现—种黄牛FBX032基因单核苷酸多态性及作为生长性状分子标记的检测方法，以包含FBX032基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P1、P2、P3为引物，PCR扩增黄牛FBX032基因部分片段；用限制性内切酶Haelll、HaeIII, BfaI分别消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛FBX032基因第22830位、第44675位、第53423位的单核苷酸多态性。所述的引物对Pl为上游引物5'CAGGTCCCCGTCCATCAGTC 3'下游引物5'GGAAGCGTTTCCAGCCATCGGC 3'所述的引物对P2为 上游引物5'GGCCCTGTCTGCCATTTATCT 3'下游引物5'TTCCATCCACTCACATTCCCT 3'所述的引物对P3为上游引物5'CCAAACAGTCACCGCATCTCC 3'下游引物5'AGGGCCTGCATCAGTCTTACC 3'所述的PCR扩增反应程序为94°C 预变性 5min ；34 个循环94°C变性 30s，Tni (分别为 66°C，58. 5°C，64. 7°C )退火 30s，72°C延伸30s ；72 延伸 IOmin。所述的根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛FBX032基因第22830位的单核苷酸多态性为AA基因型表现为长度为131bp的一条带；AG基因型表现为长度分别为131bp、IlObp和2Ibp的三条带；GG基因型表现为长度分别为IlObp和2Ibp的两条带。第44675位的单核苷酸多态性为TT基因型表现为长度为331bp的一条带；TC基因型表现为长度分别为331bp、257bp和74bp的三条带；CC基因型表现为长度分别为257bp和74bp的两条带。第53423位的单核苷酸多态性为GG基因型表现为长度为587bp的一条带；AG基因型表现为长度分别为587bp、450bp和137bp的三条带；AA基因型表现为长度分别为450bp和137bp的两条带。本专利技术根据FBX032基因的序列设计引物，分别以6种黄牛品种构建的基因组DNA池为模板，进行PCR扩增，并对PCR产物进行测序，测序后得到黄牛FBX032基因的部分序列，与NCBI公布的序列进行比较发现在第22830位、第44675位、第53423位存在单核苷酸多态性。针对上述三处SNP多态性，本专利技术还公开了其筛查和检测方法，通过设计特定的弓I物进行PCR扩增，并用特定的限制性内切酶酶切PCR产物鉴定，能够简单、快速、成本低、精确的检测其单核苷酸的多态性。本专利技术对6个黄牛品种的SNP基因型进行了检测和基因频率分析，对上述SNP位点与南阳牛部分生长性状(体重和日增重等)进行关联分析，结果表明该位点能够作为提高黄牛生长性状的分子标记。附图说明图I为黄牛FBX032基因酶切电泳结果图，其中图la、lb、lc、分别为黄牛FBX032基因包含第22830位、第44675位、第53423位的多态位点PCR产物的酶切电泳结果。图2为黄牛FBX032基因SNP多态性测序结果图，其中图2a、2b、2c分别为黄牛FBX032基因包含第22830位、第44675位、第53423位多态位点的测序结果图，不同颜色的曲线代表不同的碱基(蓝线表示C碱基的测序峰，红线代表T碱基的测序峰；黑线代表G碱基的测序峰；绿线代表A喊基的测序峰)。图3为黄牛FBX032基因部分DNA序列图，其中图3a、3b、3c分别为黄牛FBX032基因包含第22830位、第44675位、第53423位的多态位点的DNA片段图。具体实施例方式本专利技术利用PCR-RFLP和ACRS-PCR-RFLP方法对黄牛FBX032基因第22830位、第44675位、第53423位的单核苷酸多态性进行检测和关联分析，下面对本专利技术做进一步的详细说明，所述是对本专利技术 的解释而不是限定。a、黄牛FBX032基因含第3外显子、第8内含子和第10内含子PCR引物的设计以NCBI所公布的牛序列(NC_007312. 4)为参考，利用Primer 5. O设计能够扩增分别包含黄牛FBX032基因第3外显子、第8内含子和第10内含子的PCR引物。扩增第3外显子的引物为上游引物5'CGACCCTCTACCGTGCGTTCC 3'下游引物5'GGGCTCCCTCCTCACCCTGTT 3'扩增第8内含子的引物为上游引物5'GGCCCTGTCTGCCATTTATCT 3'下游引物5'TTCCATCCACTCACATTCCCT 3'扩增第10内含子的引物为上游引物5'CCAAACAGTCACCGCATCTCC 3'下游引物5'AGGGCCTGCATCAGTCTTACC 3'以上述引物对黄牛基因组扩增，分别扩增包含黄牛FBX032基本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种黄牛FBXO32基因单核苷酸多态性及作为分子标记的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以包含FBXO32基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P1、P2、P3为引物，PCR扩增黄牛FBXO32基因部分片段，所述的引物对P1为：上游引物：5′CAGGTCCCCGTCCATCAGTC？3′下游引物：5′GGAAGCGTTTCCAGCCATCGGC？3′所述的引物对P2为：上游引物：5′GGCCCTGTCTGCCATTTATCT？3′下游引物：5′TTCCATCCACTCACATTCCCT？3′所述的引物对P3为：上游引物：5′CCAAACAGTCACCGCATCTCC？3′下游引物：5′AGGGCCTGCATCAGTCTTACC？3′上述引物对在FBXO32基因(NCBI参考序列号：NC_007312.4)中的位置如下：P1：上游引物：322bp～341bp；下游引物：431bp～452bp；P2：上游引物：738bp～758bp；下游引物：1049bp～1069bp；P3：上游引物：53299bp～53319bp；下游引物：53855bp～53875bp；(2)以限制性内切酶HaeIII、HaeIII、BfaI分别消化PCR扩增产物之后；(3)对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛FBXO32基因(NCBI参考序列号：NC_007312.4)第22830位、第44675位、第53423位的单核苷酸多态性。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈宏，王爱兰，蓝贤勇，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：
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