一种单核苷酸多态性分析方法技术

本发明专利技术涉及一种单核苷酸多态性分析方法。揭示了一种测定已知单核苷酸多态性的新方法；针对待测基因模板，设计特异性引物分别向两个不同的方向扩增，控制另外两条分别与特异性引物配对的外围引物扩增效率，使整个PCR反应体系在野生型或者纯合突变型标本检测时只有一种型特异性PCR产物，在杂合标本检测时有两种PCR产物，明确区分野生型/杂合型/突变型。本发明专利技术为临床检测提供了一种结果稳定、重复性好、适用机型广的SNP分析方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及体外诊断核酸分析检测
；更具体地，本专利技术涉及。
技术介绍
单核苷酸多态性(Singlenucleotide polymorphism, SNP),是指基因组 DNA 中某一特定核苷酸位置上发生转换、颠换、插入或缺失等变化。SNP在人类基因组中广泛存在，大概每1000个碱基就有一个SNP。SNP是人类遗传学变异中最常见的一种。绝大多数疾病的发生与环境因素和遗传因素的综合作用有关，通常认为是在个体具有遗传易感性的基础上，环境有害因素作用而导致疾 病。不同群体和个体对疾病的易感性、抵抗性以及其他生物学性状(如对药物的反应性等)有差别，其遗传学基础是人类基因组DNA序列的变异性，其中最常见的是SNP，占所有已知多态性的90%以上。随着人类基因组计划的进展，人们愈来愈相信基因组中的SNP有助于解释个体的表型差异、不同群体和个体对疾病，特别是对复杂疾病的易感性以及对各种药物的耐受性和对环境因子的反应。因此，寻找和研究SNP已成为人类基因组计划的内容和目标之一。继限制性片段长度多态性和微卫星多态性这两个遗传标记之后，成为第三代分子标记。SNP具有数量多，分布广及高度稳定性，适于快速、规模化筛查，易于基因分型等特点，很适合对复杂性状与疾病的遗传解剖以及基于群体的基因识别等方面的研究。SNP检测在分子诊断、临床检验、法医学、病原检测、遗传疾病和新药研发等方面凸显出越来越重要的价值。SNP检测技术发展很快，出现了许多SNP检测技术。大致可以分为以下几种:(1)测序方法:Sanger双脱氧测序，焦磷酸测序(Pyrosequencing),SNaPshot微测序；(2)基于杂交的方法:Taqman探针法，DNA芯片法；(3)熔解曲线:高分辨率熔解曲线分析技术(High Resolution Melt, HRM) ； (4)引物延伸:基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix Assisted Laser Desorption 1nization Time of Flight, MALD1-T0F)；[5]变性高效液相色谱技术(DenaturingHigh Performance Liquid Chromatography,DHPLC) ；(6)以构象为基础的方法:限制性片段长度多态性分析法(RestrictionFragment Length Polymorphism, RFLP)，单链构象多态性分析法(Single StrandConformation Polymorphism, SSCP),变性梯度凝胶电泳法(Denaturing Gradient GelElectrophoresis, DGGE)。各种不同的检测方法，各有优缺点，以构象为基础的方法目前已很少使用，Sanger测序是SNP检测的金标准，能发现已知SNP，也能发现未知SNP ;缺点是每个样本的每个位点均需要经PCR扩增，跑胶，然后切胶纯化，再测序，步骤多而分散，成本较高，工作量大，周期长，价格昂贵，不适合大样本多位点检测。微测序方法(SNaPshot)类似普通测序，10个位点PCR产物同时引物延伸，通量增加；劣势在于每个样品的每个位点都需要PCR预先扩增，跑胶，割胶，DNA纯化。10个位点可以同时测序，提高了测序效率，但对延伸引物要求极高，如每个引物有4-6个碱基差异，不能有互补区段，还要相同条件延伸，除厂家已经验证的少数位点外，很难自己设计针对新位点的检测。多个分散步骤，费钱费时，易出错。基于杂交的方法包括实时荧光Taqman探针检测和DNA芯片法，只能检测已知SNP位点，不能同时发现未知SNP，Taqman探针法的通量低，DNA芯片法的准确性低，需重复验证。MALD1-TOF和DHPLC优点是快捷、所需样标本量极少，MALD1-TOF适宜于已经优化的特定SNP检测，不适宜该服务从未做过的新SNP检测。DHPLC可判断有否突变，不能确定SNP的位置和类型，需用标准样品或结合测序验证。不同核酸分子的片段长短、GC含量、GC分布等是不同的,任何双链DNA分子在加热变性时都会有自己熔解曲线的形状和位置。高分辨率熔解曲线分析(high resolutionmelting analysis, HRM)就是在PCR反应体系中加入饱和染料，在PCR反应完成后进行升温变性，并在升温过程中采集荧光信号，随着温度升高，双链DNA逐渐减少，荧光强度也就下降了，仪器实时记录温度和荧光强度的变化，形成熔解曲线，根据熔解曲线的不同来对样品来进行区分。高分辨率熔解曲线-HRM技术具有如下优点:高通量、简单、快速、低成本、高灵敏度；闭管检测，避免污染造成的假阳性；可检测已知和未知SNP ;与传统的扩增后需借助额外的仪器进行凝胶电泳的非均一性的突变检测(例如dHPLC)相比，HRM提供了更高特异性和灵敏度的检测，同时允许更高的样本检测通量，大大降低了成本。高分辨率熔解曲线对应分析为图像学分析，所有分析都基于野生型、突变型、杂合型参比品熔解曲线的结果，目前实验过程中，突变型多为质粒，质粒和标本扩增效率还是存在差异的，最后熔解曲线峰和实际的标本扩增结果有差异，会导致实验结果误判。另外HRM对标本定量要求非常严格，如果标本定量不准，不同标本之间扩增效率会有差异，会影响后面的分析结果，两种纯合状态可能会误判，也可能会被判读为未知突变。在标本定量较准的情况下，也有可能因为不同标本中存在的抑制PCR扩增的因素不一样，导致扩增效率有所不同，同样也会干扰 最后的分析结果。针对高分辨率熔解曲线法的一些弊端，需要一种适用机型更广，结果稳定，重复性好，适用于临床应用的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种新的单核苷酸多态性分析方法。本专利技术提供一种基于等位基因特异性扩增的SNP检测方法，包括如下步骤:(I)以待测基因为模板，以针对SNP位点的特异性引物以及与特异性引物配对的外围引物为引物，以Taq DNA聚合酶进行PCR扩增；其中，所述的针对SNP位点的特异性引物包括:针对野生型等位基因位点的内引物1，以其3’末端碱基起算第1-3位的碱基与野生型SNP位点碱基匹配；针对突变型等位基因位点的内引物2，以其3’末端碱基起算第1-3位的碱基与突变型SNP位点碱基匹配而；所述的外围引物是远离SNP位点的引物，包括:与内引物I构成引物对的外围引物1，与内引物2构成引物对的外围引物2 ;并且，控制(抑制)外围引物I和外围引物2的扩增效率使之比内引物I和内引物2的扩增效率低；使外围引物I和外围引物2之间不形成扩增产物；(2)分析PCR扩增产物，确定待测样品中待测基因的SNP类型(包括:野生型基因、突变型基因或杂合型基因)。在一个优选例中，步骤(1)中，控制扩增效率的方法是:控制外围引物I的Tm值，使之比内引物I的Tm值低1-8°C (较佳地低2-7V ;更佳地低3_6°C ;如5°C );控制外围引物2的Tm值，使之比内引物2的Tm值低2_8 V (较佳地低2_7 V ；更佳地低3_6 V ；如5 0C )。在另一优选例中，步骤(1)中，控制扩增效率的方法是:控制外围引物I浓度使之比内引物I的浓度低5-20倍；控制外围引物2浓度使之比内引物2的浓度低5-20倍。在另一优本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于等位基因特异性扩增的SNP检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)以待测基因为模板，以针对SNP位点的特异性引物以及与特异性引物配对的外围引物为引物，以Taq DNA聚合酶进行PCR扩增；其中，所述的针对SNP位点的特异性引物包括：针对野生型等位基因位点的内引物1，以其3’末端碱基起算第1‑3位的碱基与野生型SNP位点碱基匹配；针对突变型等位基因位点的内引物2，以其3’末端碱基起算第1‑3位的碱基与突变型SNP位点碱基匹配而；所述的外围引物是远离SNP位点的引物，包括：与内引物1构成引物对的外围引物1，与内引物2构成引物对的外围引物2；并且，控制外围引物1和外围引物2的扩增效率使之比内引物1和内引物2的扩增效率低；使外围引物1和外围引物2之间不形成扩增产物；(2)分析PCR扩增产物，确定待测样品中待测基因的SNP类型。

【技术特征摘要】
1.一种基于等位基因特异性扩增的SNP检测方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)以待测基因为模板，以针对SNP位点的特异性引物以及与特异性引物配对的外围引物为引物，以Taq DNA聚合酶进行PCR扩增； 其中，所述的针对SNP位点的特异性引物包括:针对野生型等位基因位点的内引物1，以其3’末端碱基起算第1-3位的碱基与野生型SNP位点碱基匹配；针对突变型等位基因位点的内引物2，以其3’末端碱基起算第1-3位的碱基与突变型SNP位点碱基匹配而； 所述的外围引物是远离SNP位点的引物，包括:与内引物I构成引物对的外围引物1，与内引物2构成引物对的外围引物2 ； 并且，控制 外围引物I和外围引物2的扩增效率使之比内引物I和内引物2的扩增效率低；使外围引物I和外围引物2之间不形成扩增产物； (2)分析PCR扩增产物，确定待测样品中待测基因的SNP类型。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，控制扩增效率的方法是:控制外围引物I的Tm值，使之比内引物I的Tm值低1_8°C ;控制外围引物2的Tm值，使之比内引物2的Tm值低1-8°C。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，控制扩增效率的方法是:控制外围引物I浓度使之比内引物I的浓度低5-20...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭安亮，姚见儿，王方金，刘榴，
申请(专利权)人：上海透景生命科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31