一种利用荧光探针检测DNA单核苷酸多态性的方法技术

本发明专利技术公开了一种DNA单核苷酸多态性的检测方法。本发明专利技术提供的方法是用荧光物质标记待测样本的DNA，通过所述荧光物质与水溶性共轭聚合物荧光共振能量转移情况确定所述待测DNA的目标单核苷酸多态位点的核苷酸。本发明专利技术处理简便，省略了各种分离、纯化步骤，利用少量DNA就能够检测到单核苷酸多态位点的核苷酸。

【技术实现步骤摘要】
一种利用荧光探针检测DNA单核苷酸多态性的方法
本专利技术涉及一种检测DNA单核苷酸多态性的方法，特别涉及一种利用荧光探针检测DNA单核苷酸多态性的方法。
技术介绍
单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，SNP),主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，SNP既可能是二等位多态性，也可能是3个或4个等位多态性，但实际上，后两者非常少见，几乎可以忽略。因此，通常所说的SNP都是二等位多态性的。单核苷酸多态性是人类可遗传的变异中最常见的一种，有90%都可归因于SNP所引起的基因变异。在人基因组中，每隔100至300个碱基就会存在一处SNP。基因组DNA中单核苷酸多态性的分析和测定可用来绘制基因图谱、进行基因联合研究等。单核苷酸多态性是第三代遗传诊断标记，近几年被广泛应用于生物以及医学研究的诸多领域，分析方法常采用电泳分析和固相杂交的方法，如：DNA测序、限制酶切片段长度多态性分析、单链DNA构象多态性分析、异源双链核酸分析、等位基因特异性寡聚核苷酸杂交、错配酶切分析、寡聚核苷酸连接分析等，但上述方法对样品处理的要求较高，需要进行繁琐的分离或洗涤的程序，增加了样品的损失以及检测的时间。为了避免上诉问题，目前常采用一种均相免疫检测的方法，该方法基于荧光偏振或小分子荧光染料之间的荧光共振能量转移，但偏振化荧光的强度大大降低，导致了基于荧光偏振的方法灵敏度不高，除此之外，基于荧光共振能量转移的方法均要对探针分子进行双修饰，导致成本很高。因此，设计出一种更为灵敏、有效的单核苷酸多态性检测方法是极为迫切的。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种克服上述缺点，高效、灵敏、简便、快速、无需分离的利用荧光探针检测DNA单核苷酸多态性的方法。实现本专利技术目的的技术方案是：一种荧光探针用于DNA单核苷酸多态性的检测方法，依次包括以下步骤：1）以待测样本的DNA为模板进行PCR扩增，并用荧光物质标记待测样本的DNA；2）通过所述荧光物质与下述式（I）的化合物荧光共振能量转移情况确定所述待测DNA的目标单核苷酸多态位点的核苷酸；所述荧光物质的吸收光谱与所述式（I）的化合物发射光谱有较好的重叠,光谱重叠积分范围为8.0×10-16～5.0×10-13M-1cm3。式（I）；式（I）中，R代表链端含有四级胺的直链或支链的烷基，所述烷基的主链长为2-12个碳，X代表卤素；所述式（I）化合物的数均分子量为5000-20000。上述一种荧光探针用于DNA单核苷酸多态性的检测方法的式（I）中，R为6-三甲胺基己基、6-三乙胺基己基、5-三甲胺基戊基、5-三乙胺基戊基、4-三甲胺基丁基、4-三乙胺基丁基、3-三甲胺基丙基和3-三乙胺基丙基中的任意一种。上述一种荧光探针用于DNA单核苷酸多态性的检测方法的式（I）中，X为氯、溴和碘中的任意一种。上述一种荧光探针用于DNA单核苷酸多态性的检测方法用荧光物质标记步骤1）的DNA的方法为：用荧光物质标记的dNTP或ddNTP对PCR扩增产物进行单碱基延伸；所述dNTP或ddNTP为与所述目标单核苷酸多态位点的核苷酸相邻的一个核苷酸互补的dNTP或ddNTP。上述一种荧光探针用于DNA单核苷酸多态性的检测方法的单碱基延伸中，所用的引物有两种：野生型特异性引物和突变型特异性引物；所述野生型特异性引物的末端核苷酸与所述目标单核苷酸多态位点的野生型核苷酸互补；所述突变型特异性引物的末端核苷酸与所述目标单核苷酸多态位点的突变型核苷酸互补；所述引物能与目标单核苷酸多态位点相邻20-25bp的序列互补。上述一种荧光探针用于DNA单核苷酸多态性的检测方法确定所述待测DNA的目标单核苷酸多态位点核苷酸的方法为：若只在使用野生型特异性引物时出现荧光共振能量转移，则所述待测DNA的目标单核苷酸多态位点的核苷酸为野生纯合型；若只在使用突变型特异性引物时出现荧光共振能量转移，则所述待测DNA的目标单核苷酸多态位点的核苷酸为突变纯合型；若使用两种引物都出现荧光共振能量转移，则所述待测DNA的目标单核苷酸多态位点的核苷酸为杂合型。上述一种荧光探针用于DNA单核苷酸多态性的检测方法的用荧光物质标记步骤1）的DNA的方法为：用荧光物质A标记与所述目标单核苷酸多态位点的野生型核苷酸互补的dNTP或ddNTP，用荧光物质B标记与所述目标单核苷酸多态位点的突变型核苷酸的互补dNTP或ddNTP，用所述荧光物质A标记的dNTP或ddNTP和荧光物质B标记的dNTP或ddNTP同时对PCR扩增产物进行单碱基延伸；在同一激发光的作用下，所述荧光物质A和所述荧光物质B产生的荧光的波长至少相差50nm。上述一种荧光探针用于DNA单核苷酸多态性的检测方法的单碱基延伸中，所用的引物能与所述目标单核苷酸多态位点相邻（上游或下游）20-25bp的序列互补。上述一种荧光探针用于DNA单核苷酸多态性的检测方法确定所述待测DNA的目标单核苷酸多态位点核苷酸的方法为：若单独出现PCP到荧光物质A的荧光共振能量转移，则所述待测DNA的目标单核苷酸多态位点的核苷酸为野生纯合型；若单独出现PCP到荧光物质B的荧光共振能量转移，则所述待测DNA的目标单核苷酸多态位点的核苷酸为突变纯合型；若两种荧光共振能量转移都出现，则所述待测DNA的目标单核苷酸多态位点的核苷酸为杂合型。上述一种荧光探针用于DNA单核苷酸多态性的检测方法的荧光物质为荧光素、罗丹明、溴乙啶、Cy3或Cy5。本专利技术具有积极的效果：本专利技术所提供的检测DNA单核苷酸多态性的方法克服了现有DNA单核苷酸多态性检测技术的种种不足，具有高效、灵敏、简便、快速、无需分离等优点。与应用最广泛的电泳分析方法相比，本专利技术处理简便，省略了各种分离、纯化步骤，利用少量DNA（基因组DNA小于25纳克，PCR产物小于100纳克）就能够检测到待测DNA的目标单核苷酸多态位点的核苷酸。附图说明为了使本专利技术的内容更容易被清楚地理解，下面根据具体实施例并结合附图，对本专利技术作进一步详细的说明，其中图1为应用PCP检测野生型样本RS1800469位点单核苷酸多态性的荧光光谱。图2为应用PCP检测突变型样本RS1800469位点单核苷酸多态性的荧光光谱。图3为应用PCP检测杂合型样本RS1800469位点单核苷酸多态性的荧光光谱。图4为应用PCP检测RS1800469位点单核苷酸多态性的荧光强度比率图。具体实施方式下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。本专利技术具体提供了两种检测DNA单核苷酸多态性的方法：方法一：引物特异性的单碱基延伸1、合成PCP；2、提取待测样本的基因组DNA；3、PCR扩增：按常规PCR方法扩增基因组DNA，扩增片断中含有目标单核苷酸多态位点。4、单碱基延伸：PCR扩增产物经核酸外切酶I和磷酸水解酶消化后，不经分离取少量按常规方法进行单碱基延伸。使用的单核苷三磷酸为荧光素标记的单核苷三磷酸。引物与目标序列匹配时，成功延伸，这样荧光素就被标记在引物上；引物与目标序列不匹配（在引物3’端最后一个碱基）时则不能延伸，荧光素不能被标记在引物上。5、荧光光谱测定：延伸产物经碱性磷酸酶消化后，不经分离取少量稀释100倍后本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种荧光探针用于DNA单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于：依次包括以下步骤：1）以待测样本的DNA为模板进行PCR扩增，并用荧光物质标记待测样本的DNA；2）通过所述荧光物质与下述式（I）的化合物荧光共振能量转移情况确定所述待测DNA的目标单核苷酸多态位点的核苷酸；所述荧光物质的吸收光谱与所述式（I）的化合物发射光谱有较好的重叠,光谱重叠积分范围为8.0×10‑16 ～ 5.0×10‑13 M‑1cm3。式（I）；式（I）中，R代表链端含有四级胺的直链或支链的烷基，所述烷基的主链长为2‑12个碳，X代表卤素；所述式（I）化合物的数均分子量为5000‑20000。

【技术特征摘要】
1.一种荧光探针用于DNA单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于：依次包括以下步骤：1)以待测样本的DNA为模板进行PCR扩增，并用荧光物质标记待测样本的DNA；2)通过所述荧光物质与下述式(I)的化合物荧光共振能量转移情况确定所述待测DNA的目标单核苷酸多态位点的核苷酸；所述荧光物质的吸收光谱与所述式(I)的化合物发射光谱在8.0×10-16～5.0×10-13M-1cm3有重叠式(I)中，R为6-三甲胺基己基，X代表卤素；所述式(I)化合物的数均分子量为5000-20000，所述方法用于非疾病诊断和治疗的目的。2.如权利要求1所述的一种荧光探针用于DNA单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于：所述式(I)中，X为氯、溴和碘中的任意一种。3.如权利要求1中所述的一种荧光探针用于DNA单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于：所述用荧光物质标记步骤1)的DNA的方法为：用荧光物质标记的dNTP或ddNTP对PCR扩增产物进行单碱基延伸；所述dNTP或ddNTP为与所述目标单核苷酸多态位点的核苷酸相邻的一个核苷酸互补的dNTP或ddNTP。4.如权利要求3所述的一种荧光探针用于DNA单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于：所述单碱基延伸中，所用的引物有两种：野生型特异性引物和突变型特异性引物；所述野生型特异性引物的末端核苷酸与所述目标单核苷酸多态位点的野生型核苷酸互补；所述突变型特异性引物的末端核苷酸与所述目标单核苷酸多态位点的突变型核苷酸互补；所述引物能与目标单核苷酸多态位点相邻20-25bp的序列互补。5.如权利要求4所述的一种荧光探针用于DNA单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于：确定所述待测DNA的目标单核苷酸多...

【专利技术属性】
技术研发人员：王树，
申请(专利权)人：常州欣宏科生物化学有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32