人源抗炭疽保护性抗原PA的抗体IgG及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种抗炭疽保护性抗原的全分子人源单克隆抗体及其应用，该抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。对该全分子人源抗体做功能鉴定和体外细胞中和实验，结果显示其能够与炭疽保护性抗原PA特异性结合，并有效的阻断炭疽毒素的致病作用，因此本发明专利技术的全分子人源单克隆抗体可应用于有关炭疽病的诊断、治疗及预防工作中。

【技术实现步骤摘要】
人源抗炭疽保护性抗原PA的抗体IgG及其应用
本专利技术属于单克隆抗体药物
，涉及一种抗炭疽保护性抗原的全分子人源单克隆抗体及其被编码的DNA分子、包含该DNA分子的表达载体、含有该表达载体的宿主细胞，以及该全分子人源单克隆抗体在制备炭疽治疗或预防性药物中的应用。
技术介绍
炭疽病是一种由炭疽芽孢杆菌引起的人畜共患的急性烈性传染病，牛、羊等食草动物的发病率最高，人可通过接触患炭疽的动物及其畜产品或通过存在于空气、土壤中的炭疽杆菌芽胞而被感染。炭疽杆菌具有高度致病性、其芽胞在恶劣环境中有较强的生存能力.可通过气溶胶途径感染，在世界范围内广泛分布等特点，临床上依据感染途径不同将炭疽分为3型，即皮肤炭疽、吸入性炭疽和消化道炭疽。吸入性炭疽，叉称肺炭疽，其致死率接近100％。炭疽芽孢杆菌在血液中可产生并释放三种蛋白：保护性抗原(protectiveantigen，PA)、致死因子(lethalfactor，LF)、水肿因子(edemafactor，EF)。实验证实，炭疽毒素是一种AB(active-binding)的模式。PA是复合物中的“B”，与细胞膜上的炭疽毒素受体(2型毛细血管形成蛋白CMG2或肿瘤肉皮细胞标志8TEM8)结合，由位于细胞膜上的Furin蛋白酶切除其氨基端20kD片段PA20，余下的63kD片段(PA63)发生寡聚化，在膜上形成七聚体((PA63)7)。LF和EF是“A”，能够结合七聚体形成的复合物通过受体介导的内吞进入细胞。在内吞小体酸性pH的环境下，PA七聚体发生构象改变，形成一个管道，使EF和LF进入细胞液，分别发挥毒性作用。这三种蛋白本身是无毒的，但PA和LF的混合物称为致死毒素，PA和EF的混合物称为水肿毒素。在体外实验研究中，单纯使用高纯度的致死毒素或水肿毒素可以使动物死亡。通过阻断PA与受体结合或是与LF及EF，以及影响其寡聚化，都可以有效防止炭疽毒素的致病作用。而且PA能诱导机体的保护性免疫，是目前唯一获美国食品药品监督管理局批准的人用炭疽吸附疫苗(anthraxvaccineabsorbed，AVA)的主要活性成分。因此，保护性抗原PA是炭疽病治疗的理想靶点。炭疽的医学防护措施主要有预防和治疗二大方面。目前，有效的预防措施主要是接种炭疽疫苗，接触前1-2个月进行预防接种，能为人群提供免疫防护。有效的治疗措施主要有二大类：一类是根据炭疽病理模型设计的毒素抑制剂，主要包括炭疽毒素的中和抗体、可溶性受体、毒素突变体和小分子拮抗剂；另一类是炭疽杆菌的抑菌剂和杀菌剂，其中包括抗菌素和噬菌体的溶菌成分。抗菌素治疗主要指炭疽感染时高剂量静脉注射和口服抗生素以对炭疽杆菌产生杀伤作用，例如青霉素、环丙沙星、四环霉素、红霉素、和万古霉素等，但对于已释放的毒素是没有效果的，而且目前已发现具抗药性的菌株。国内外的研究表明，在暴露于炭疽芽孢之前使用抗PA抗体，能够起到预防炭疽感染保护机体的作用。而且，在孢子攻毒后一定时间给药(24-48h)仍能起到保护作用，即使是在出现体征后给药也可以起到一定的治疗作用。因此，进行人源炭疽抗体的研究显得尤为重要和迫切。
技术实现思路
鉴于现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种抗炭疽保护性抗原的全分子人源单克隆抗体及其被编码的DNA分子、包含该DNA分子的表达载体、含有该表达载体的宿主细胞，以及该全分子人源单克隆抗体在制备炭疽治疗或预防性药物中的应用。为了实现本专利技术的上述目的，本专利技术人通过大量试验研究和不懈探索，最终采用噬菌体抗体库技术筛选到了对炭疽保护性抗原PA具有高度亲和力的人源Fab抗体，并获取了赋予所述抗体优异特性的重链和轻链可变区的氨基酸序列和核苷酸序列，并将所述抗体的重链和轻链可变区与含有抗体恒定区的表达载体连接，最终获得了具有特异的抗原结合性、优异的毒素中和活性以及良好的动物保护功能的全分子人源抗体。具体地，本专利技术第一方面提供了如下全分子人源单克隆抗体的技术方案：一种抗炭疽保护性抗原的全分子人源单克隆抗体，包含重链可变区、恒定区，和轻链可变区、恒定区，其中：(1)所述的重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体；且(2)所述的轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体。需要说明的是，该抗体的重链可变区区和轻链可变区均为人源抗体，并将其与人源抗体的恒定区连接，因此称之为全分子人源抗体。进一步优选地，如上所述的全分子人源单克隆抗体，其中：(1)所述的重链恒定区的氨基酸序列如SEQIDNO.6所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体；且(2)所述的轻链恒定区的氨基酸序列如SEQIDNO.8所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体。本专利技术第二方面提供一种DNA分子，其编码上述的全分子人源单克隆抗体的至少如下一个区域：重链可变区、重链恒定区、轻链可变区、轻链恒定区。进一步优选地，如上所述的DNA分子，其编码重链可变区的核酸序列为SEQIDNO.1所示，编码轻链可变区的核酸序列为SEQIDNO.3所示。再进一步优选地，如上所述的DNA分子，其编码重链恒定区的核酸序列为SEQIDNO.5所示，编码轻链恒定区的核酸序列为SEQIDNO.7所示。本专利技术第三方面提供一种表达载体，该表达载体中包含有上述的任意一种DNA分子。所述载体优选为抗体IgG1亚型分泌型真核表达载体。比如，在一个最优选的实施例中，本专利技术提供的IgG质粒表达载体为pFUSE-CHIg-hG1和pFUSE-CLIg-hk，其包含人源IgG1亚型的重链和轻链(Kappa)的恒定区核苷酸序列，编码重链恒定区的具体核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，编码轻链恒定区的具体核苷酸序列如SEQIDNO.7所示。本专利技术第四方面提供一种含有上述表达载体的宿主细胞，宿主细胞为FreeStyleTM293-Fcells。由于本专利技术提供的全分子人源单克隆抗体可以作为药物分子特异性识别和结合炭疽保护性抗原PA，从而抑制PA装配或与细胞结合来发挥作用，预防炭疽感染或者治疗炭疽感染性疾病。因此，本专利技术第五方面还提供了上述全分子人源单克隆抗体在制备预防或治疗炭疽病的药物中的应用，以及提供了一种以该全分子人源单克隆抗体为活性成分的预防或治疗炭疽病的药物组合物。与现有技术相比，本专利技术提供了一种具有高保护性、高特异性、良好亲和力的抗PA的全分子人源单克隆抗体(IgG-PA21)。对该全分子人源抗体PA21做功能鉴定，结果显示该全分子人源抗体能够与炭疽保护性抗原PA特异性结合；体外细胞中和实验结果证实，人源抗PA抗体能够有效的阻断炭疽毒素的致病作用。以Fischer344大鼠为模型，体内试验证实PA21抗体在毒素给予前或是毒素给予后一定时间内都具有良好的保护效果。PA是炭疽芽孢杆菌在血液中释放的蛋白，因此本专利技术的单克隆抗体可应用于有关炭疽病的诊断、治疗及预防工作中。附图说明图1为纯化IgG抗体PA21的SDS-PAGE检测结果，M，marker；1，P本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗炭疽保护性抗原的全分子人源单克隆抗体，包含重链可变区、恒定区，和轻链可变区、恒定区，其特征在于：(1)所述的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体；且(2)所述的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体。

【技术特征摘要】
1.一种抗炭疽保护性抗原的全分子人源单克隆抗体，包含重链可变区、恒定区，和轻链可变区、恒定区，其特征在于：（1）所述的重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；且（2）所述的轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。2.根据权利要求1所述的全分子人源单克隆抗体，其特征在于：（1）所述的重链恒定区的氨基酸序列如SEQIDNO.6所示；且（2）所述的轻链恒定区的氨基酸序列如SEQIDNO.8所示。3.一种DNA分子，其编码权利要求1所述的全分子人源单克隆抗体的重链可变区、重链恒定区、轻链可变区和轻链恒定区，编码重链可变区的核酸序列为SEQIDNO.1所示，编码轻...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱进，熊四平，冯振卿，
申请(专利权)人：中国人民解放军南京军区军事医学研究所，
类型：发明
国别省市：江苏;32