猪链球菌2型divIVA基因敲除突变株及其应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程领域，涉及猪链球菌2型divIVA基因敲除突变株及其应用。所述突变株ΔdivIV制备方法为：利用同源重组基因敲除技术将S.suis 2野生株05ZYH33染色体上编码DivIVA蛋白的divIVA基因进行基因敲除，经组合PCR产物电泳、RT‑PCR和DNA测序证实，确定所获得的菌株为基因敲除突变株，命名为05ZYH33ΔdivIVA。用本发明专利技术所述突变株进行动物实验研究其致病性，其结果是对实验动物的毒力显著降低，可应用于研制猪链球菌2型减毒疫苗。

DivIVA gene knockout mutant strain of Streptococcus suis type 2 and its application

【技术实现步骤摘要】
猪链球菌2型divIVA基因敲除突变株及其应用
本专利技术属于基因工程领域，涉及猪链球菌2型divIVA基因敲除突变株及其应用。
技术介绍
猪链球菌(Streptococcussuis,S.suis)是一种世界范围内流行的人畜共患病病原菌，不仅可致猪脑膜炎、败血症、关节炎、肺炎及心内膜炎等，而且还可感染人并导致多种严重的疾病，给相关从业者和广大群众的生命安全造成严重威胁。根据荚膜多糖的抗原性，S.suis可分为35个血清型，其中2型(Streptococcussuisserotype2，S.suis2)毒力最强，临床检出率最高。近年我国南方省份的猪群中S.suis2流行日趋严重，时有较大规模暴发，每年造成的经济损失达数十亿元。1998和2005年分别在我国江苏省和四川省暴发了大规模S.suis2感染人的事件，造成了重大生命财产损失，并且病人中出现了高比例的、国内外罕见的中毒性休克综合征，病情凶险，病死率高(60％～80％)，引发严重的公共卫生事件。同时，近年来国际上关于S.suis感染和致病的报道也显著增多，并有报道显示在我国香港已经检测出该菌多重耐药菌株的存在，给S.suis2的预防和控制带来了新的挑战。因此，开展S.suis2的相关基础和应用研究，对于防控S.suis2感染在人畜中的流行，进一步提高我国S.suis预防和治疗水平具有重要意义。在过去的近半个世纪中，针对S.suis2的研究主要集中于细菌毒力因子、表面蛋白成分以及信号调控元件等，已发现了包括荚膜多糖(CPS)、溶菌酶释放蛋白(muraminidasereleasedprotein，MRP)、胞外因子(extracellularfactor，EF)、溶血素(suilysin，Sly)、谷氨酸脱氢酶(glutamatedehydrogenase,GDH)、分选酶A(sortaseA)、二肽酶Ⅳ(DipeptidylPeptidaseIV)、烯醇化酶(Enolase)以及猪链球菌组氨酸三聚体蛋白(HistidinetriadproteinofS.suis，Htps)等多个与细菌致病性相关的因子。这些毒力因子的发现对理解S.suis2的致病过程有一定的帮助。但是对细菌自身生命和代谢活动分子机制的研究较少，尤其在S.suis细胞分裂机制方面的研究鲜有报道。细胞分裂、增殖是病原菌感染宿主的基础，参与细胞分裂的蛋白种类很多，不同细菌中又不尽相同。因此，对S.suis细胞分裂机制的研究对于深入揭示其生理代谢过程，从而促进针对性预防措施的研发具有重要意义。DivIVA蛋白是在多种革兰氏阳性菌中发现的由divIVA基因编码的细胞分裂相关蛋白。近年来在枯草芽孢杆菌、耻垢分枝杆菌、粪肠球菌、单核细胞增多性李斯特氏菌和肺炎链球菌中均发现该蛋白参与调控细菌的正常细胞分裂。课题组通过对S.suis2人源分离的强毒株05ZYH33的基因组分析，发现了1个DivIVA蛋白编码基因。据报道，单核细胞增多性李斯特氏菌该基因的缺失会导致细菌的泳动性变差、生物被膜形成受阻以及对细胞的侵染能力减弱，影响细菌毒力及致病性。但目前为止尚无人对S.suis2中该基因功能及其参与细菌细胞分裂和致病性进行研究。开展对S.suis2致病菌致病机理及预防和控制的研究已成为国内外相关领域许多学者的共同选择。疫苗作为一种安全有效的病原菌防控手段成为当今应对S.suis2感染的研究热点。减毒活疫苗是传统的疫苗，以全菌体为基础，接种剂量小，免疫效果较好，免疫力较持久。因此减毒活疫苗研究成为S.suis2新型疫苗研发的一个重要方向。本专利技术的突变菌株为减毒疫苗的开发提供了重要价值。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的上述不足，提供一株猪链球菌2型(Streptococcussuisserotype2，S.suis2)divIVA基因敲除突变株。本专利技术的另一目的是提供该突变株的应用。本专利技术的目的可通过如下技术方案实现：S.suis2的divIVA基因敲除突变株，将2型猪链球菌05ZYH33菌株中的divIVA基因从第1位至690位之间的全长编码序列用壮观霉素抗性基因盒(Spectinomycinresistancecassette,以下简称SpcR)代替。其中所述的05ZYH33菌株中的divIVA基因全长编码序列如SEQIDNO.1所示。所述的壮观霉素抗性基因盒序列如SEQIDNO.2所示。构建所述的S.suis2divIVA基因敲除突变株的方法，包含以下步骤：(1)根据如SEQIDNO.3所示的S.suis2野生株05ZYH33基因组divIVA编码基因的上游DNA序列，设计PCR特异引物L1和L2；根据如SEQIDNO.4所示的S.suis2野生株05ZYH33基因组divIVA编码基因的下游DNA序列，设计PCR特异引物R1和R2；以pSET2质粒为模板，设计一对特异引物spc1和spc2；其中引物L1序列如SEQIDNO.5所示，引物L2序列如SEQIDNO.6所示，引物R1序列如SEQIDNO.7所示，引物R2序列如SEQIDNO.8所示，引物spc1序列如SEQIDNO.9所示，引物spc2序列如SEQIDNO.10所示；(2)以05ZYH33基因组DNA为模板，分别以L1/L2和R1/R2为引物，扩增得到两端分别含EcoRI/BamHI酶切位点的目的基因divIVA上游DNA序列LA片段和两端分别含SalI/SphI酶切位点的目的基因divIVA下游DNA序列RA片段；以pSET2质粒为模板，以Spc1/Spc2为特异引物扩增得到两端分别含BamHI/SalI酶切位点的壮观霉素抗性基因盒；L1/L2、R1/R2和Spc1/Spc2三对引物扩增所得PCR产物经1％琼脂糖电泳检测分别获得的目的片段大小为1000bp(LA片段)、961bp(RA片段)和1130bp(SpcR)。PCR产物回收、纯化，分别用EcoRI/BamHI、SalI/SphI和BamHI/SalI进行双酶切，将双酶切产物回收、纯化，冻存备用。(3)基因敲除载体pUC::divIVA的构建：将所述的LA片段-壮观霉素抗性基因盒-RA片段插入pUC18载体的EcoRI/BamHI酶切位点间得基因敲除载体pUC::divIVA；具体包含如下步骤：(a)LA的克隆：将EcoRI/BamHI双酶切后的LA片段与用同样内切酶双酶切处理过的重组质粒pUC18进行连接，16℃过夜后将连接产物转化DH5a大肠杆菌感受态细胞，经氨苄青霉素筛选后，挑取LB平板上的克隆培养于LB液体培养基中37℃振荡过夜。次日提取质粒DNA，用EcoRI/BamHI进行双酶切鉴定，筛选出有1000bp左右大小DNA片段出现的阳性质粒,命名为pUC18-L。(b)壮观霉素抗性基因SpcR的克隆：将BamHI/SalI双酶切后的产物与用同样内切酶双酶切处理过的重组质粒pUC18-LR进行连接，16℃过夜后将连接产物转化DH5a大肠杆菌感受态细胞，经壮观霉素和氨苄青霉素双重筛选后，挑取LB平板上的克隆培养于LB液体培养基中37℃振荡过夜。次日提取质粒DNA，用BamHI/SalI进行双酶切鉴定，筛选出有1100bp左右大小DNA片段出现的阳性质粒，命名为本文档来自技高网...

【技术保护点】
猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype 2，S.suis 2)divIVA基因敲除突变株，其特征在于，将猪链球菌2型05ZYH33菌株中的divIVA基因从第1位至690位之间的全长编码序列用壮观霉素抗性基因盒所代替。

【技术特征摘要】
1.猪链球菌2型(Streptococcussuisserotype2，S.suis2)divIVA基因敲除突变株，其特征在于，将猪链球菌2型05ZYH33菌株中的divIVA基因从第1位至690位之间的全长编码序列用壮观霉素抗性基因盒所代替。2.根据权利要求1所述的S.suis2divIVA基因敲除突变株，其特征在于所述的05ZYH33菌株中的divIVA基因的全部编码序列如SEQIDNO.1所示。3.根据权利要求1所述的S.suis2divIVA基因敲除突变株，其特征在于所述的壮观霉素抗性基因盒序列如SEQIDNO.2所示。4.构建权利要求1所述的S.suis2divIVA基因敲除突变株的方法，其特征在于包含以下步骤：⑴根据如SEQIDNO.3所示的S.suis2野生株05ZYH33基因组divIVA编码基因的上游DNA序列，设计特异性PCR引物L1和L2；根据如SEQIDNO.4所示的S.suis2野生株05ZYH33基因组divIVA编码基因的下游DNA序列，设计特异性PCR引物R1和R2；以pSET2质粒为模板，设计一对特异引物Spc1和Spc2；其中引物L1序列如SEQIDNO.5所示，引物L2序列如SEQIDNO.6所示，引物R1序列如SEQIDNO.7所示，引物R2序列如SEQIDNO.8所示，引物Spc1序列如SEQIDNO.9所示，引物Spc2序列如SEQIDNO.10所示；⑵以05ZYH33基因组DNA为模板，分别以L1/L2和R1/R2为引物，扩增得到两端分别含EcoRI/BamHI酶切位点的目的基因divIVA上游DNA序列LA片段和两端分别含SalI/SphI酶切位点的目的基因divIVA下游DNA序列RA片段；以pSET2质粒为模板，以Spc1/Spc2为引物扩增得到两端分别含BamHI/SalI酶切位点的壮观霉素抗性基因盒；(3)基因敲除载体pUC::divIVA的构建：将所述的LA片段-壮观霉素抗性基因盒-RA片段插入pUC18载体的SalI/Sph1酶切位点间得基因敲除载体pUC::divIVA；(4)基因敲除载体pUC::divIVA电转化制备好的S.suis2野生株05ZYH33感受态细胞；(5)筛选具有壮观霉素抗性的S.suis2菌落，经组合PCR产物电泳、RT-PCR和DNA测序证实divIVA目的基因被壮观霉素抗性基因盒替换。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述的基因敲除载体pUC::divIVA的构建包含如下步骤：(a)LA的克隆：将EcoRI/BamHI双酶切后的LA片段与用同样内切酶双酶切处理过的重组质粒pUC18进行连接，得重组质粒pUC18-L；(b)壮观霉素抗性基因盒的克隆：将BamHI/SalI双酶切后的产物与用同样内切酶双酶切处理过的重组质粒pUC18-L进行连接，得重组质粒pUC18-LS；(c)RA的克隆：将SalI/Sph1双酶切后的R...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘秀珍，倪华，王长军，沈玉洁，胡丹，郑峰，
申请(专利权)人：中国人民解放军南京军区军事医学研究所，
类型：发明
国别省市：江苏,32