辅因子再生分枝杆菌及其在油水双液相发酵中的应用制造技术

本发明专利技术属于生物催化技术领域，具体涉及一种具有辅因子再生功能的分枝杆菌基因工程菌及其在双液相发酵系统中的应用。本发明专利技术通过对胞内NADH氧化系统进行改造构建了用于植物甾醇生物转化的基因工程菌，解决了油水双液相发酵系统中雄烯二酮转化效率低的问题，并为油水双液相发酵系统在工业生产雄烯二酮中的广泛应用提供可能。本发明专利技术构建的基因工程菌MNR M3N2在油水双液相系统发酵法降解植物甾醇制备雄烯二酮过程中，可使AD(D)产量提高1.4‑2.9倍。

Auxiliary factor regenerated Mycobacterium and its application in double liquid phase fermentation of oil and water

The invention belongs to the field of biocatalysis technology, and specifically relates to a Mycobacterium genetic engineering bacterium with cofactor regeneration function and its application in two liquid fermentation system. The present invention of intracellular NADH oxidation system transformation is proposed for the genetic engineering of plant sterol biotransformation bacteria, solve the oil-water two-phase fermentation androst-4-ene-3,17-dione in two low efficiency problem in the system, and for the oil-water two-phase fermentation system is widely used in industrial production of androst-4-ene-3,17-dione in two in may. Gene engineering strain MNR M3N2 constructed by the invention in oil-water two liquid phase fermentation degradation of phytosterol androst-4-ene-3,17-dione in two preparation process, the AD (D) production increased 1.4 to 2.9 times.

【技术实现步骤摘要】
辅因子再生分枝杆菌及其在油水双液相发酵中的应用
：本专利技术属于生物催化
，具体涉及一种具有辅因子再生功能的分枝杆菌基因工程菌及其在双液相发酵系统中的应用。
技术介绍
：雄烯二酮，雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)和雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)，是生产可的松、盐皮质激素类药物、常规口服避孕药和蛋白同化激素等其他甾体激素类药物的重要中间体，可以通过微生物降解植物甾醇侧链获得。植物甾醇,为疏水性化合物，溶解度很低，易聚集在水相表面，而甾体转化酶属于胞内酶,底物只有扩散进入细胞才能与酶接触而进行转化反应，这就导致植物甾醇与转化酶不能很好的接触，造成转化率偏低，发酵时间长等问题。针对以上问题目前提高雄烯二酮产量的方法主要集中于：1、植物甾醇代谢途径中酶的改造；2、提高底物植物甾醇的溶解性及利用率。关于植物甾醇代谢途径中酶的改造，主要集中于通过过表达或敲除植物甾醇氧化途径中的酶来提高AD(D)生产效率及产量。例如过表达胆固醇氧化酶及3β-羟基甾体脱氢酶等，或失活3-酮甾体-9α-羟化酶(Ksh)以及3-酮甾体-1-脱氢酶(KstD)。研究结果显示敲除某基因以后，会在不同程度上降低植物甾醇的转化率和产率，即造成菌体整体生产强度的下降，限制了工业化生产的应用。所以,目前需要从菌体整体代谢调控方面深入探索、系统研究，以寻求提高雄烯二酮生产效率的方法。双液相发酵的研究是指在发酵液中加入一种与水不相溶的有机相，促进植物甾醇的溶解。由于环境约束及适应绿色化学的倡导，有机溶剂在工业生产中的利用减少成为趋势，天然油作为“绿色溶剂”是有机溶剂很好的替代物。但是迫于油相体系的植物甾醇转化效率不高，影响了它在雄烯二酮生产中的广泛应用。一般代谢工程研究主要集中于特定代谢途径中酶编码基因的基因改造，包括基因的过表达或基因敲除。然而，对代谢途径中酶编码基因的直接改造并不一定能带来预期的效果。辅因子依赖的代谢途径不仅受代谢途径中酶的控制，而且还受辅因子浓度及辅因子氧化还原态比值的控制。因此，对代谢工程来说，辅因子改造是一种潜在的强有力的改造菌株的方法。辅因子工程即采用分子生物学手段，改造胞内辅因子再生途径，近而调控微生物胞内辅因子的形式及浓度，定向改变和优化细胞代谢功能，实现代谢流最大化、快速化导向目标代谢产物的工程。它被认为是代谢工程的一个新分支，已经引起了越来越多的关注。
技术实现思路
：本专利技术所要解决的技术问题为克服植物甾醇生物转化过程中菌株代谢缓慢及底物溶解度低的问题，将辅因子再生系统引入到甾体转化微生物中，以提高重组微生物在油水双液相发酵系统中雄烯二酮的转化效率，为解决菌体植物甾醇代谢缓慢提供了新方法，并为油水双液相发酵系统在工业生产雄烯二酮中的广泛应用提供可能。本专利技术实现上述目的的技术方案如下：一株产雄烯二酮的基因工程菌，是以新金分枝杆菌为宿主细胞，异源表达NADH氧化酶基因nox-2获得的；所述nox-2的核苷酸序列如序列表SEQIDNO.1所示优选地，所述宿主细胞为新金分枝杆菌(Mycobacteriumsp.)MNRM3，可从中国工业微生物菌种保藏管理中心(简称CICC)购买获得，编号CICC21097，以CICC21097为宿主细胞，异源表达NADH氧化酶基因nox-2获得的基因工程菌命名为MNRM3N2。所述基因工程菌MNRM3N2的构建方法，具体如下：(1)将nox-2基因(SEQIDNO.1)和表达质粒pMV261通过酶切，连接，构建pMV261-nox-2重组质粒；(2)将重组质粒pMV261-nox-2导入MNRM3的感受态细胞中，获得的阳性转化子即为本专利技术新构建菌株MNRM3N2。本专利技术提供的技术方案之二，是利用上述构建的MNRM3N2菌株在油水双液相体系中发酵生产雄烯二酮的方法，具体如下：将MNRM3N2按5-10％(v/v)的接种量接种入油水双液相发酵培养基中，28-32℃，130-250r/min，pH6.5-7.8条件下，发酵4-8天；所述油水双液相发酵培养基组成如下：K2HPO40.5g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L,柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，磷酸氢二铵3.5g/L，葡萄糖10g/L，油相10-20％(v/v)，其余为水，pH6.5-7.8；所述油相为植物油，选自大豆油、葵花油、菜籽油、花生油、米糠油或妥尔油中的至少一种；进一步地，所述油水双液相发酵培养基中还添加0.5-8g/L的乳化剂；所述的乳化剂为卵磷脂、Tween80、Span80、蔗糖酯以及单甘酯中的至少一种。有益效果：(1)本专利技术通过对胞内NADH氧化系统进行改造构建了用于植物甾醇生物转化的基因工程菌，解决了油水双液相发酵系统中雄烯二酮转化效率低的问题，并为油水双液相发酵系统在工业生产雄烯二酮中的广泛应用提供可能。(2)本专利技术构建的基因工程菌MNRM3N2在油水双液相系统发酵法降解植物甾醇制备雄烯二酮过程中，可使AD(D)产量提高1.4-2.9倍。附图说明：图1nox-2基因扩增电泳图；图2阳性转化子pMV261-nox-2质粒双酶切验证图。具体实施方式：为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本专利技术。实施例1重组菌株MNRM3N2的构建1、构建pMV261-nox-2质粒，其过程包括：(1)合成目的基因，根据乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcuslactissubsp.cremoris)NZ9000NADH氧化酶基因nox-2的核苷酸序列(GeneID:13019046,SEQIDNO.1),将酶切位点(BamHI及SalI)添加于nox-2序列的两端，将所设计的序列交由金唯智公司进行基因合成；(2)PCR扩增目的基因片段nox-2基因(验证图为图1)，目的片段nox-2及表达质粒pMV261分别用BamHI和SalI双酶切，纯化，连接获得重组质粒pMV261-nox-2。2、构建菌株MNRM3N2：(1)分枝杆菌MNRM3感受态细胞制备：一级种子培养至OD600为1.0左右,按10％接种量转接到种子培养基中进行二级种子培养；24h后加入2％甘氨酸继续培养24h。离心收集菌体，分四次用10％预冷甘油冲洗悬浮菌体并离心，最后加入甘油悬浮菌体，并分装保存；种子培养基组成:K2HPO40.5g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，硝酸铵2g/L，甘油20g/L，葡萄糖5g/L，CaCO310g/L，其余为水，pH7.2；(2)电转化：10μL步骤1所得重组质粒加入100μL感受态菌体中放置10min，电击条件如下：1.5KV条件下电转两次，每次4-5ms；(3)重组子筛选与验证：电转产物加入种子培养基复苏培养3-5h后，涂布于含有卡那霉素(50mg/L)种子培养基平板上，30℃静置培养7d，挑取单菌落至液体种子培养基培养，提取质粒进行双酶切验证(验证图为图2)，双酶切理论出现4500bp与1300bp大小的两条带，酶切验证正确的阳性转化子即为重组菌MNRM3N2。实施例2重组菌MNRM3N2中NAD(H)含量及NAD+/NA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株产雄烯二酮的基因工程菌MNR M3N2，其特征在于，所述基因工程菌是以编号为CICC21097的新金分枝杆菌(Mycobacterium sp.)MNR M3为宿主细胞，异源表达NADH氧化酶基因nox‑2所得，所述nox‑2的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一株产雄烯二酮的基因工程菌MNRM3N2，其特征在于，所述基因工程菌是以编号为CICC21097的新金分枝杆菌(Mycobacteriumsp.)MNRM3为宿主细胞，异源表达NADH氧化酶基因nox-2所得，所述nox-2的核苷酸序列如序列表SEQIDNO.1所示。2.权利要求1所述基因工程菌MNRM3N2的构建方法，其特征在于，具体如下：(1)将nox-2基因和表达质粒pMV261通过酶切，连接，构建pMV261-nox-2重组质粒；(2)将重组质粒pMV261-nox-2导入MNRM3的感受态菌株中，获得的阳性转化子即为本发明新构建菌株MNRM3N2。3.权利要求1所述基因工程菌MNRM3N2在油水双液相发酵体系中的应用。4.权利要求3所述基因工程菌MNRM3N2的应用，其特征在于，所述基因工程菌MNRM3N2在油水双液相发酵体系中发酵生产雄烯二酮的方法如下...

【专利技术属性】
技术研发人员：王敏，苏立秋，申雁冰，商志华，高田，张文凯，骆健美，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津,12