The present disclosure provides compositions and methods for the use of modified hydrogen trophic microbes, which can selectively utilize CO and / or CO2 gas or transform CO and / or CO2 gas to methionine in the presence of H2.
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于甲硫氨酸的生物生产的组合物和方法关于序列表的声明与本申请相关的序列表以文本格式提供代替纸质副本,并且通过引用在此并入本说明书中。包含序列表的文本文件的名称为910215_407WO_SEQUENCE_LISTING.txt。该文本文件为30.5KB,创建于2016年5月6日,并通过EFS-Web以电子方式提交。
技术介绍
甲硫氨酸是含硫的必需氨基酸,其可用于食品和医疗行业的各种应用。例如,甲硫氨酸被用作动物饲料和食品中的添加剂,并用作许多药物中的成分。因此,对甲硫氨酸有高的工业需求。为了满足该高需求,已通过复杂的化学合成来以合成方式制造甲硫氨酸,所述化学合成涉及难处理的原料例如甲硫醇、丙烯和氰化氢。甲硫氨酸的合成生产需要严酷的生产环境或产生对环境有害的副产物。由于起始材料的高成本和合成生产的环境影响,优选通过发酵生产甲硫氨酸的方法。然而,甲硫氨酸的高效发酵生产由于甲硫氨酸中硫原子的存在而复杂化。此外,目前的发酵方法利用糖和碳水化合物作为起始碳源。针对全年生产和环境问题寻找可靠的原材料使碳水化合物的使用复杂化。例如,许多碳水化合物废物来源(例如,残留作物生物质)可以被发酵,但是是季节性的。可替代地,可以栽培一些作物以产生用于工业发酵反应的碳水化合物。然而,这些方法减少了可用于食物生产的耕地,而且是昂贵的。鉴于对甲硫氨酸的高需求以及可发酵的碳水化合物的较高成本和不可靠性,本领域需要以成本有效的方式生物生产甲硫氨酸的替代和改进的方法。本公开满足这样的需要,并且还提供了其它相关优点。专利技术详述本公开提供了用于代谢工程改造(例如,改变基因、基因表达、基因表达调控)氢 ...
【技术保护点】
一种非天然经工程改造的氢营养型微生物,其中所述经工程改造的氢营养型微生物任选地在H2的存在下代谢COx底物,以产生与亲本氢营养型微生物相比更高水平的甲硫氨酸,并且其中所述经工程改造的氢营养型微生物表达经遗传工程改造的内源多肽,所述经遗传工程改造的内源多肽包括:(a)具有如在SEQ ID NO:4和8中的至少一个中所给出的氨基酸序列的经遗传工程改造的多肽;(b)具有与SEQ ID NO:4和8中的至少一个包含至少90%的序列同一性的氨基酸序列的经遗传工程改造的多肽,其中所述经工程改造的多肽对于一种或更多种反馈抑制剂失调;(c)由与SEQ ID NO:2和6中的至少一个包含至少70%的序列同一性的核酸分子编码的经遗传工程改造的多肽,其中所述经遗传工程改造的多肽对于一种或更多种反馈抑制剂失调;或者(d)由在严格条件下与SEQ ID NO:2和6的全长互补序列杂交的核酸分子编码的经遗传工程改造的多肽,其中所述经遗传工程改造的多肽对于一种或更多种反馈抑制剂失调。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.05.06 US 62/157,7971.一种非天然经工程改造的氢营养型微生物,其中所述经工程改造的氢营养型微生物任选地在H2的存在下代谢COx底物,以产生与亲本氢营养型微生物相比更高水平的甲硫氨酸,并且其中所述经工程改造的氢营养型微生物表达经遗传工程改造的内源多肽,所述经遗传工程改造的内源多肽包括:(a)具有如在SEQIDNO:4和8中的至少一个中所给出的氨基酸序列的经遗传工程改造的多肽;(b)具有与SEQIDNO:4和8中的至少一个包含至少90%的序列同一性的氨基酸序列的经遗传工程改造的多肽,其中所述经工程改造的多肽对于一种或更多种反馈抑制剂失调;(c)由与SEQIDNO:2和6中的至少一个包含至少70%的序列同一性的核酸分子编码的经遗传工程改造的多肽,其中所述经遗传工程改造的多肽对于一种或更多种反馈抑制剂失调;或者(d)由在严格条件下与SEQIDNO:2和6的全长互补序列杂交的核酸分子编码的经遗传工程改造的多肽,其中所述经遗传工程改造的多肽对于一种或更多种反馈抑制剂失调。2.根据权利要求1所述的非天然氢营养型微生物,其中所述经工程改造的多肽是海沼甲烷球菌S2DSM14266的MMP1359的同源物或直系同源物。3.根据权利要求2所述的非天然氢营养型微生物,其中所述同源物或直系同源物在残基D439处包含突变,其中所述残基编号对应于来自海沼甲烷球菌S2DSM14266的MMP1359的残基位置。4.根据权利要求2或3所述的非天然氢营养型微生物,其中所述突变是D439N取代,并且所述残基编号对应于来自海沼甲烷球菌S2DSM14266的MMP1359的残基位置。5.根据权利要求1-4中任一项所述的非天然氢营养型微生物,其中所述经工程改造的多肽是海沼甲烷球菌S2DSM14266的MMP1358的同源物或直系同源物。6.根据权利要求5所述的非天然氢营养型微生物,其中所述同源物或直系同源物在残基G114处包含突变,并且所述残基编号对应于来自海沼甲烷球菌S2DSM14266的MMP1358的残基位置。7.根据权利要求5或6所述的非天然氢营养型微生物,其中所述突变是G114E取代,并且所述残基编号对应于来自海沼甲烷球菌S2DSM14266的MMP1358的残基位置。8.根据权利要求1-7中任一项所述的非天然氢营养型微生物,其中所述非天然氢营养型微生物还包含失调的天冬氨酸激酶活性、甲硫氨酸合酶或两者。9.根据权利要求8所述的非天然氢营养型微生物,其中所述失调的天冬氨酸激酶活性是内源天冬氨酸激酶、外源天冬氨酸激酶或两者。10.根据权利要求8或9所述的非天然氢营养型微生物,其中所述失调的天冬氨酸激酶活性是对赖氨酸、苏氨酸或甲硫氨酸中的一种或更多种的反馈抑制具有抗性的天冬氨酸激酶突变体。11.根据权利要求8-10所述的非天然氢营养型微生物,其中所述失调的天冬氨酸激酶活性由突变thrA基因、突变metL基因、突变lysC基因或其组合编码,所述突变thrA基因、突变metL基因、突变lysC基因或其组合各自包含自发突变、随机突变、位点特异性突变或其任意组合。12.根据权利要求8-11中任一项所述的非天然氢营养型微生物,其中所述失调的天冬氨酸激酶活性由在苏氨酸结合位点处包含突变的突变lysC基因编码。13.根据权利要求12所述的非天然氢营养型微生物,其中所述苏氨酸结合位点突变在残基I272、D274、G277、E278、A279、D294、Q298、N372、N374、I375或其任意组合处,其中所述残基编号对应于由谷氨酸棒杆菌ATCC13032的lysC编码的残基位置。14.根据权利要求8-13中任一项所述的非天然氢营养型微生物,其中所述失调的天冬氨酸激酶活性由在赖氨酸结合位点处包含突变的突变lysC基因编码。15.根据权利要求14所述的非天然氢营养型微生物,其中所述赖氨酸结合位点突变在残基I291、I293、D294、T361、S381、E382或其任意组合处,其中所述残基编号对应于由谷氨酸棒杆菌ATCC13032的lysC编码的残基位置。16.根据权利要求8-15中任一项所述的非天然氢营养型微生物,其中所述失调的内源天冬氨酸激酶活性由在赖氨酸和苏氨酸结合位点处包含突变的突变lysC基因编码。17.根据权利要求16所述的非天然氢营养型微生物,其中所述赖氨酸和苏氨酸结合位点突变在残基D294处,其中所述残基编号对应于由谷氨酸棒杆菌ATCC13032的lysC编码的残基位置。18.根据权利要求8-17中任一项所述的非天然氢营养型微生物,其中所述失调的天冬氨酸激酶活性由在不同于赖氨酸或苏氨酸结合位点的位点处包含突变的突变lysC基因编码。19.根据权利要求18所述的非天然氢营养型微生物,其中所述不同于赖氨酸和苏氨酸结合位点的位点处的突变在残基F283、N299、S301、S302、T308、T311、T336、G359、F364、M365、T380、R384、S386或其任意组合处,其中所述残基编号对应于由谷氨酸棒杆菌ATCC13032的lysC编码的残基位置。20.根据权利要求1-19中任一项所述的非天然氢营养型微生物,其中所述非天然氢营养型微生物还包含编码来自甲硫氨酸生物合成途径的一种或更多种多肽的外源核酸分子。21.根据权利要求20所述的非天然氢营养型微生物,其中所述来自甲硫氨酸生物合成途径的一种或更多种多肽选自天冬氨酸激酶、天冬氨酰半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸O-乙酰基转移酶、高丝氨酸O-反式琥珀酰基转移酶、O-琥珀酰基高丝氨酸裂解酶、胱硫醚γ-合酶、胱硫醚β-裂解酶、O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶、高半胱氨酸S-甲基转移酶、甲硫氨酸合酶(钴胺素依赖性或非依赖性)或其任意组合。22.根据权利要求20所述的非天然氢营养型微生物,其中所述外源核酸分子编码高丝氨酸脱氢酶、丝氨酸乙酰基转移酶或两者,或者所述外源核酸分子编码高丝氨酸O-乙酰基转移酶、O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶或两者。23.根据权利要求22所述的非天然氢营养型微生物,其中所述高丝氨酸脱氢酶、丝氨酸乙酰基转移酶或两者过表达,或者其中所述高丝氨酸O-乙酰基转移酶、O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶或两者过表达。24.根据权利要求22或23所述的非天然氢营养型微生物,其中所述高丝氨酸脱氢酶、丝氨酸乙酰基转移酶或两者失调,或者其中所述高丝氨酸O-乙酰基转移酶、O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶或两者失调。25.根据权利要求20-24中任一项所述的非天然氢营养型微生物,其中其中所述外源核酸分子编码甲硫氨酸合酶。26.根据权利要求25所述的非天然氢营养型微生物,其中与缺乏编码甲硫氨酸合酶的所述外源核酸分子的亲本氢营养型微生物相比,所述甲硫氨酸合酶过表达。27.根据权利要求20-26中任一项所述的非天然氢营养型微生物,其中编码来自赖氨酸生物合成途径的多肽的一种或更多种核酸分子被敲除或具有降低的活性。28.根据权利要求20-27中任一项所述的非天然氢营养型微生物,其中编码来自苏氨酸生物合成途径的多肽的一种或更多种核酸分子被敲除或具有降低的活性。29.根据权利要求27或28所述的非天然氢营养型微生物,其中编码二氢吡啶二羧酸合酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸脱水酶、苏氨酸醛缩酶、丝氨酸羟甲基转移酶或其任意组合的核酸分子被敲除或编码活性降低的二氢吡啶二羧酸合酶突变体、高丝氨酸激酶突变体、苏氨酸脱水酶突变体、苏氨酸醛缩酶突变体、丝氨酸羟甲基转移酶突变体或其任意组合。30.根据权利要求9-29中任一项所述的非天然氢营养型微生物,其中所述外源核酸分子整合在所述非天然氢营养型微生物的基因组中。31.根据权利要求9-29中任一项所述的非天然氢营养型微生物,其中所述外源核酸分子在所述非天然氢营养型微生物中呈自我复制载体的形式。32.根据权利要求1-31中任一项所述的非天然氢营养型微生物,其中所述非天然氢营养型微生物是赖氨酸营养缺陷体、苏氨酸营养缺陷体、甘氨酸营养缺陷体或其任意组合。33.根据前述权利要求中任一项所述的非天然氢营养型微生物,其中所述非天然氢营养型微生物具有降低的磷酸烯醇丙酮酸合酶活性、增加的丙酮酸激酶活性或两者。34.根据前述权利要求中任一项所述的非天然氢营养型微生物,其中所述非天然氢营养型微生物具有增加的丙酮酸羧化酶活性、增加的5-甲基四氢叶酸类咕啉/铁硫蛋白甲基转移酶活性、增加的丙酮酸合酶、增加的乙酰辅酶A合酶、增加的天冬氨酸转氨酶活性或其任意组合。35.根据前述权利要求中任一项所述的非天然氢营养型微生物,其中所述COx底物是由H2、CO和CO2构成的H2/COx底物。36.根据前述权利要求中任一项所述的非天然氢营养型微生物,其中所述COx底物是由合成气或水-气变换过的合成气构成的H2/COx底物。37.根据权利要求35或36所述的非天然氢营养型微生物,其中CO2与H2的比例范围分别为约1:50至约10:1。38.根据权利要求35或36所述的非天然氢营养型微生物,其中CO2与H2的比例范围分别为约1:2至约1:4。39.根据权利要求35-38中任一项所述的非天然氢营养型微生物,其中CO的总量不超过约1%。40.根据权利要求1-39中任一项所述的非天然氢营养型微生物,其中所述氢营养型微生物是产甲烷古细菌。41.根据权利要求40所述的非天然氢营养型微生物,其中所述产甲烷古细菌选自甲烷杆菌属、甲烷短杆菌属、甲烷砾菌属、甲烷热球菌属、产甲烷胞菌属、甲烷球菌属、甲烷拟球菌属、甲烷粒菌属、甲烷袋状菌属、甲烷泡菌属、产甲烷菌属、甲烷盐菌属、甲烷嗜盐菌属、甲烷裂叶菌属、甲烷叶菌属、甲烷食甲基菌属、甲烷微菌属、甲烷微球菌属、甲烷盘菌属、甲烷火菌属、Methanoregula、甲烷鬃毛状菌属、甲烷咸菌属、甲烷八叠球菌属、甲烷球形菌属、Methanospirillium、甲烷热杆菌属、甲烷热球菌属、甲烷热菌属或甲烷炎菌属。42.根据权利要求40所述的非天然氢营养型微生物,其中所述产甲烷古细菌选自由以下组成的组:嗜碱甲烷杆菌、布氏甲烷杆菌、刚果甲烷杆菌、德氏甲烷杆菌、埃斯帕诺拉甲烷杆菌、甲酸甲烷杆菌、伊氏甲烷杆菌、沼泽甲烷杆菌、热聚甲烷杆菌、泥沼甲烷杆菌、抗酸甲烷短杆菌、嗜树木甲烷短杆菌、戈氏甲烷短杆菌、奥氏甲烷短杆菌、瘤胃甲烷短杆菌、史氏甲烷短杆菌、伍氏甲烷短杆菌、沃氏甲烷短杆菌、Methanocellaarvoryzae、Methanocellaconradii、居烂泥甲烷胞菌、马堡甲烷热杆菌、热自养甲烷热杆菌、热弯曲甲烷热杆菌、嗜热甲烷热杆菌、沃氏甲烷热杆菌、集结甲烷嗜热菌、巴伐利亚甲烷粒菌、小甲烷粒菌、筑后甲烷袋状菌、海底甲烷袋状菌、低温产甲烷菌、Methanogeniumliminatans、海洋产甲烷菌、居蟑螂甲烷微球菌、内共生甲烷盘菌、居泥甲烷盘菌、石油甲烷盘菌、坎氏甲烷火菌、Methanoregulaboonei、Methanosaetaconcilii、竹节状甲烷鬃毛状菌、Methanosaetapelagica、嗜热甲烷鬃毛状菌、乙酸甲烷八叠球菌、巴氏甲烷八叠球菌、马氏甲烷八叠球菌、嗜热甲烷八叠球菌、运动甲烷微菌、Methanococcusaeolicus、海沼甲烷球菌、万氏甲烷球菌、沃氏甲烷球菌、热自养甲烷热球菌、坎氏甲烷火菌、热自养甲烷热杆菌、沸泉甲烷热球菌、印度洋甲烷热球菌、热液口甲烷热球菌、詹氏甲烷热球菌以及火神甲烷热球菌。43.根据权利要求40-42中任一项所述的非天然氢营养型微生物,其中所述产甲烷古细菌不产生细胞色素。44.根据权利要求43所述的非天然氢营养型微生物,其中不产生细胞色素的所述产甲烷古细菌是海沼甲烷球菌或万氏甲烷球菌。45.根据权利要求40-42中任一项所述的非天然氢营养型微生物,其中所述产甲烷古细菌产生细胞色素。46.根据权利要求45所述的非天然氢营养型微生物,其中产生细胞色素的所述产甲烷古细菌是巴氏甲烷八叠球菌或马氏甲烷八叠球菌。47.根据前述权利要求中任一项所述的非天然氢营养型微生物,其中所述非天然氢营养型微生物表达或过表达甲硫氨酸的输出者。48.根据前述权利要求中任一项所述的非天然氢营养型微生物,其中所述非天然氢营养型微生物还包含编码甲硫氨酸的输出者的外源核酸分子。49.根据权利要求47或48所述的非天然氢营养型微生物,其中所述输出者是brnFE或metT基因。50.一种重组氢营养型微生物,其中所述重组氢营养型微生物任选地在H2的存在下代谢COx底物以产生与亲本氢营养型微生物相比更高水平的甲硫氨酸,其中所述重组氢营养型微生物表达外源多肽,所述外源多肽包括:(a)具有SEQIDNO:3、4、7或8中的至少一个中所给出的氨基酸序列的多肽;(b)具有与SEQIDNO:3、4、7或8中的至少一个包含至少90%的序列同一性的多肽,其中所述多肽任选地对于一种或更多种反馈抑制剂失调;(c)由与SEQIDNO:1、2、5或6中的至少一个包含至少70%的序列同一性的核酸分子编码的多肽,其中所述多肽任选地对于一种或更多种反馈抑制剂失调;或者(d)由在严格条件下与SEQIDNO:1、2、5或6的全长互补序列杂交的核酸分子编码的多肽,其中所述多肽任选地对于一种或更多种反馈抑制剂失调。51.根据权利要求50所述的重组氢营养型微生物,其中所述多肽是来自海沼甲烷球菌S2DSM14266的MMP1359的同源物或直系同源物。52.根据权利要求51所述的重组氢营养型微生物,其中所述同源物或直系同源物在残基D439处包含突变,其中所述残基编号对应于来自海沼甲烷球菌S2DSM14266的MMP1359的残基部分。53.根据权利要求51或52所述的重组氢营养型微生物,其中所述突变为D439N取代,并且所述残基编号对应于由海沼甲烷球菌S2DSM14266的MMP1359编码的残基位置。54.根据权利要求48-51中任一项所述的重组氢营养型微生物,其中所述微生物包含基因的突变,所述基因是来自海沼甲烷球菌S2DSM14266的MMP1358的直系同源物。55.根据权利要求54所述的重组氢营养...
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