3‑羟基丁酸的生产制造技术

提供了能够生产乙酰乙酸、3‑羟基丁酸和/或3‑羟基丁酸变体的微生物细胞，其中所述细胞被基因修饰以包含相对于其野生型细胞下述增加的表达：‑能够催化乙酰辅酶A转化成乙酰乙酰辅酶A的酶E1；‑能够催化乙酰乙酰辅酶A转化为乙酰乙酸的酶E2；和‑能够催化乙酰乙酸转化为3‑羟基丁酸和/或其变体的酶E3。

3 hydroxy butyric acid production

Provide the microbial cells for the production of 3 acetoacetate, 3-hydroxybutyrate and / or 3 hydroxybutyrate variants, wherein the cells are genetically modified to contain the following with respect to the expression of wild-type cells increased: can catalyze acetyl coenzyme A into E1 enzyme acetyl coenzyme A; catalyzes acetyl coenzyme A into the E2 enzyme can catalyze and acetoacetate; acetoacetic acid into the enzyme E3 3 hydroxy butyric acid and / or its variants.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】3-羟基丁酸的生产
本专利技术涉及生产3-羟基丁酸和/或其变体的生物技术方法。特别地，该方法涉及通过乙酰乙酰辅酶A和乙酰乙酸从碳源生物技术生产3-羟基丁酸。
技术介绍
3-羟基丁酸也称为β-羟基丁酸，是具有式CH3CH(OH)CH2CO2H的有机化合物。它是一种β羟基酸，且是具有两种对映体D-3-羟基丁酸和L-3-羟基丁酸的手性化合物。其氧化和聚合衍生物广泛存在于自然界中。3-羟基丁酸是聚酯的前体，其是包括聚（3-羟基丁酸酯）的生物可降解的塑料。3-羟基丁酸也是用于生产2-羟基异丁酸和含有2-羟基异丁酸单体单元（包括甲基丙烯酸）的聚羟基链烷酸酯的前体。甲基丙烯酸、其酯和聚合物广泛用于生产丙烯酸玻璃板、注射模塑产品、涂料和许多其他产品。本领域已知有几种用于制备3-羟基丁酸的方法。然而，这些方法大多使用石油作为生产3-羟基丁酸的起始点。石油和石油基产品的过度利用已造成了环境问题，包括CO2大气浓度增加、石油化学生产和使用造成的污染以及生物不可降解的塑料材料的处理。更重要的是，石油资源在自然界中是有限的，且不可再生。由于这些原因，有必要寻求替代方法来使用可再生资源生产燃料和化学药品。近年来，光合作用蓝细菌因其能够分别利用太阳能和CO2作为唯一能源和碳源，作为生产生物燃料和化学药品的‘微生物工厂’，已引起了相当大的关注。蓝细菌也是天然存在的生物可降解塑料聚羟基丁酸酯（PHB）的天然生产者。尽管有通过基因工程策略和培养条件的最优化两者来提高PHB生物合成的努力，但蓝细菌的PHB生物合成是一个多级培养过程，其涉及氮饥饿，然后补充果糖或乙酸，其不利用蓝细菌的重要光合潜力。最重要的是，由于细胞既不分泌脂质也不分泌PHB，所以其提取所需的过程是耗能的，并且仍然是商业应用的主要障碍之一。因此，本领域需要更有效和/或可替代的生产3-羟基丁酸的生物技术方法。
技术实现思路
本专利技术提供了已经过基因修饰以产生乙酰乙酸的细胞。特别地，细胞可能能够将乙酰乙酸转化为3-羟基丁酸。这是有利的，因为可以使用单个细胞来生产3-羟基丁酸，从而使得该过程更简单并且不需要分离步骤，并因此在这个过程中没有材料损失。根据本专利技术的任何方面的细胞还可以被重新使用，从而减少废物并且导致3-羟基丁酸的总体提高的生产效率。3-羟基丁酸也可以由废气产生，因此不依赖化石燃料。根据本专利技术的一个方面，提供了能够生产3-羟基丁酸和/或其变体的微生物细胞，其中所述细胞被基因修饰以包含相对于其野生型细胞下述增加的表达：-能够催化乙酰辅酶A转化成乙酰乙酰辅酶A的酶E1；-能够催化乙酰乙酰辅酶A转化为乙酰乙酸的酶E2；和-能够催化乙酰乙酸转化为3-羟基丁酸和/或其变体的酶E3，条件是所述基因修饰细胞具有降低的乙酰乙酸脱羧酶（adc；EC4.1.1.4）表达或不表达乙酰乙酸脱羧酶（adc；EC4.1.1.4）。如本文中与细胞或微生物一起使用的短语“野生型”可以表示具有野生中天然看到的形式的基因组组成。该术语可能适用于整个细胞和个别基因两者。因此，术语“野生型”不包括这样的细胞或这样的基因，其中基因序列已被人类使用重组方法至少部分改变。技术人员将能够使用本领域已知的任何方法来基因修饰细胞或微生物。根据本专利技术的任何方面，基因修饰细胞可以被基因修饰，从而使得在限定的时间间隔内，在2小时内，特别是在8小时或24小时内，其形成的乙酰乙酸和/或3-羟基丁酸为野生型细胞的至少2倍，尤其至少10倍、至少100倍、至少1000倍或至少10000倍。产物形成的增加可以通过例如在相同条件（相同细胞密度、相同营养培养基、相同培养条件）下在合适营养培养基中各自独立地培养根据本专利技术的任何方面的细胞和野生型细胞确定的时间间隔，并然后测定营养培养基中目标产物（3-羟基丁酸）的量来确定。基因修饰细胞或微生物可以与野生型细胞或微生物在遗传上不同。根据本专利技术的任何方面的基因修饰微生物与野生型微生物之间的遗传差异可以是在基因修饰微生物中存在可能在野生型微生物中不存在的完整基因、氨基酸、核苷酸等。在一个实例中，根据本专利技术的任何方面的基因修饰微生物可包含使微生物能够生产乙酰乙酸和/或3-羟基丁酸和/或其变体的酶。相对于本专利技术的基因修饰微生物的野生型微生物可以不具有或不具有可检测到的使得基因修饰微生物能够生产乙酰乙酸和/或3-羟基丁酸和/或其变体的酶的活性。如本文所用的，术语‘基因修饰微生物’可以与术语‘基因修饰细胞’互换使用。根据本专利技术的任何方面的基因修饰在微生物的细胞上进行。根据本专利技术的任何方面的细胞根据本领域已知的任何方法进行遗传转化。特别地，可以根据WO/2009/077461中公开的方法生产细胞。如本文所用的，短语‘基因修饰的细胞与其野生型相比具有增加的酶活性’是指相应酶的活性增加到至少2倍，特别是至少10倍，更特别是至少100倍，还更特别是至少1000倍，且甚至更特别是至少10000倍。在一个实例中，根据本专利技术的任何方面的增加的酶表达可以是与野生型细胞中的所述酶的表达相比多5、10、15、20、25、30、25、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100％。类似地，根据本专利技术的任何方面的降低的酶表达可以是与野生型细胞中的所述酶的表达相比少5、10、15、20、25、30、25、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100％。本文使用的短语‘增加的酶活性’应理解为增加的细胞内活性。基本上，通过增加编码酶的基因序列或多个基因序列的拷贝数、使用强启动子或利用编码具有增加的活性的相应酶的基因或等位基因并任选地组合这些措施可以实现酶促活性中的增加。用于根据本专利技术的方法中的基因修饰细胞例如通过转化、转导、接合或这些方法的组合由含有所需基因、该基因的等位基因或其部分的载体和使得基因可能表达的载体生产。异源表达特别通过将基因或等位基因整合到细胞染色体或染色体外复制载体中来实现。在一个实例中，细胞中‘增加的酶活性’可以指细胞中酶的超表达。根据本专利技术的任何方面的微生物可以是产乙酸细菌。如本文所用的术语“产乙酸细菌”是指能够执行Wood-Ljungdahl途径并因此能够将CO、CO2和/或氢转化为乙酸的微生物。这些微生物包括其野生型形式不具有Wood-Ljungdahl途径，但是由于基因修饰已经获得了这个性状的微生物。这样的微生物包括但不限于大肠杆菌（E.coli）细胞。这些微生物也可以称为一氧化碳营养菌。目前，本领域已知21个不同的产乙酸细菌属（Drake等，2006），并且这些属也可以包括一些梭状芽胞杆菌（clostridia）（Drake＆Kusel，2005）。这些细菌能够使用二氧化碳或一氧化碳作为碳源，以氢作为能源（Wood，1991）。此外，醇、醛、羧酸以及大量己糖也可用作碳源（Drake等，2004）。导致乙酸形成的还原途径称为乙酰辅酶A或Wood-Ljungdahl途径。特别地，产乙酸细菌可以选自潮湿厌氧醋菌（Acetoanaerobiumnotera）(ATCC35199)、长醋丝菌（Acetonemalongum）(DSM6540)、甲醇醋酸杆菌（Acetobacteriumcarbinolicum）(DSM2925)、苹果酸醋酸杆菌（Ac本文档来自技高网...

【技术保护点】
能够生产乙酰乙酸、3‑羟基丁酸和/或3‑羟基丁酸变体的微生物细胞，其中所述细胞被基因修饰以包含相对于其野生型细胞下述增加的表达：‑ 能够催化乙酰辅酶A转化成乙酰乙酰辅酶A的酶E1；‑ 能够催化乙酰乙酰辅酶A转化为乙酰乙酸的酶E2；和‑ 能够催化乙酰乙酸转化为3‑羟基丁酸和/或其变体的酶E3，且其中所述基因修饰细胞具有降低的乙酰乙酸脱羧酶（Adc；EC 4.1.1.4）表达或不表达乙酰乙酸脱羧酶（Adc；EC 4.1.1.4）。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.07.29 EP 15178769.41.能够生产乙酰乙酸、3-羟基丁酸和/或3-羟基丁酸变体的微生物细胞，其中所述细胞被基因修饰以包含相对于其野生型细胞下述增加的表达：-能够催化乙酰辅酶A转化成乙酰乙酰辅酶A的酶E1；-能够催化乙酰乙酰辅酶A转化为乙酰乙酸的酶E2；和-能够催化乙酰乙酸转化为3-羟基丁酸和/或其变体的酶E3，且其中所述基因修饰细胞具有降低的乙酰乙酸脱羧酶（Adc；EC4.1.1.4）表达或不表达乙酰乙酸脱羧酶（Adc；EC4.1.1.4）。2.根据权利要求1的细胞，其中E1是硫解酶，E2是乙酰乙酸辅酶A转移酶和/或E3是仲醇脱氢酶。3.根据权利要求1或2的细胞，其中硫解酶（E1）来自丙酮丁醇梭菌（C.acetobutylicum）。4.根据前述权利要求中任一项的细胞，其中所述乙酰乙酸辅酶A转移酶（E2）来自丙酮丁醇梭菌（C.acetobutylicum）。5.根据前述权利要求中任一项的细胞，其中所述仲醇脱氢酶（E3）来自拜氏梭菌（C.beijerinckii）。6.根据前述权利要求中任一项的细胞，其中-E1包含与SEQIDNO：2的60％序列同一性，-E2包含与SEQIDNO：4或6的60％序列同一性，和/或-E3包含与SEQIDNO：NO：8的60％序列同一性。7.根据前述权利要求中任一项的细胞，其中-E1包含SEQIDNO：2，-E2包含SEQIDNO：4和6，以及-E3包含SEQIDNO：8。8.根据前述权利要求中任一项的细胞，其中所述细胞是产乙酸细胞。9.根据权利要求8的细胞，其中所述产乙酸细胞选自ClostridiumautothenogenumDSMZ19630、ClostridiumragsdahleiATCCno.BAA-622、Clostridiumautoethanogenum、穆尔氏菌属物种（Moorellasp.）HUC22-1、热醋穆尔氏菌（Moorellathermoaceticum）、热自养穆尔氏菌（Moorellathermoautotrophica）、产生瘤胃球菌（Ruminococcusproductus）、厌氧醋菌属（Acetoanaerobum）、普氏产醋杆菌(Oxobacterpfennigii）、巴氏甲烷八叠球菌（Methanosarcinabarkeri）、噬乙酸甲烷八叠球菌（Methanosarcinaac...

【专利技术属性】
技术研发人员：T哈斯，A赫克，M珀特，T比尔特，
申请(专利权)人：赢创德固赛有限公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE