用于改善丙氨酸生产的重组微生物制造技术

本发明专利技术涉及重组核酸分子、重组微生物、生产丙氨酸的方法、以及重组核酸分子或重组微生物用于发酵生产丙氨酸的用途。

Recombinant microorganism for the improvement of alanine production

The invention relates to a recombinant nucleic acid molecule, a recombinant microorganism, a method for producing alanine, and a recombinant nucleic acid molecule or a recombinant microorganism for the production of alanine by fermentation.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于改善丙氨酸生产的重组微生物专利
本专利技术涉及重组核酸分子、重组微生物、用于生产丙氨酸的方法、和重组核酸分子或重组微生物用于发酵生产丙氨酸的用途。
技术介绍
氨基酸是具有羧基和氨基的有机化合物。最重要的氨基酸是α-氨基酸，其中氨基的位置紧挨着羧基。蛋白质基于α-氨基酸。丙氨酸因为用作食品、饲料和制药工业中的添加剂而吸引了相当大的兴趣。而且丙氨酸是用于工业生产N,N-双(羧甲基)-丙氨酸三钠盐(MGDA,商品名TrilonM)的原料，该三钠盐是强的螯合剂,在溶解有机和无机污垢方面显示优良的性能(WO94/29421、WO2012/150155)。根据标准的OECD试验，TrilonM级是可容易地生物降解的。由于极好的生态学和毒理学性质,TrilonM级特别地适于在用于最终用户的产品中使用并且对这样的可生物降解的复杂助洗剂的需求在不断地增长。可以通过采用棒杆菌(Coryneformbacteria)(Hermann,2003:IndustrialproductionofaminoacidsbyCoryneformbacteria,J.ofBiotechnol,104,155-172)或大肠杆菌(WO2007/120198、WO2008/119009)发酵来生产丙氨酸。在大肠杆菌中生产丙氨酸是更加有效的并且被广泛地用于作为化工原料的丙氨酸的工业生产。由于化学工业对于丙氨酸的需求在增大,需要改善发酵生产丙氨酸的生产力。本专利技术的一个目的是，提供可以以高产率和效率用于丙氨酸发酵生产的微生物。专利技术详述对上述目的的实现，大肠杆菌(E.coli)家族的重组微生物提供了助力，所述重组微生物相比于相应的参比微生物，具有引入的、增加的或增强的asd或gdhA基因的活性和/或表达，所述asd或gdhA基因在所述微生物中编码天冬氨酸-β-半醛脱氢酶或谷氨酸脱氢酶，其中所述微生物与不包含所述引入的、增加的或增强的asd或gdhA基因的活性和/或表达的相应对照微生物相比。因此，本专利技术的一个实施方式是重组微生物，其相比于相应的参比微生物包含引入的、增加的或增强的asd或gdhA基因的活性和/或表达，所述asd或gdhA基因编码天冬氨酸-β-半醛脱氢酶或谷氨酸脱氢酶，并且其相比于相应的参比微生物在发酵生产中具有更高的丙氨酸产率和/或生产力。术语“更高的”、“增加的”或“增强的”，例如当涉及酶的表达和/或活性或产率或生产力时,意指与参比或对照微生物相比显著地更高的、增加的或增强的表达和/或活性、或产率或生产力。术语“酶的减小的、受抑制的或缺失的表达和/或活性”意指，在参比或对照微生物中相应酶的显著减小的、受抑制的或缺失的表达和/或活性，并且也包括检测不到的表达和/或活性。如本文中所用的，术语“参比微生物”意指与重组微生物比较的对照微生物。除了将要分析的差别以外，这种参比微生物基本上具有与重组微生物相同的基因型。优选地，参比微生物是重组微生物所来源的株系。例如,一种基因已经被引入野生型微生物中,因而产生重组微生物,在这种情况下，野生型将会是这种重组微生物的合适的参比微生物。也可以是:把进一步的突变引入到重组微生物A中，从而产生重组微生物B。重组微生物A于是将会是重组微生物B的合适的参比微生物。如果比较重组微生物和相应的参比微生物的性能，则两种微生物在基本上相同的条件下生长。对于技术人员来说显而易见的是，具有增加的丙氨酸产率和/或生产力的微生物也可以用于生产与丙氨酸密切相关的其它代谢物,例如作为丙氨酸途径中的中间体的代谢物、与丙氨酸途径共享共同的中间体的代谢物、或使用丙氨酸作为其途径中的中间体的代谢物。还可以通过增加或引入某些酶活性或通过敲除或降低某些酶活性，容易地改变本专利技术所述的微生物，使其具有这样的有关代谢物的增加产率/或生产力。这样的代谢物例如是丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸和亮氨酸。例如,为了使用本专利技术所述的重组微生物来生产琥珀酸,基因ldh、pfl、pta和adhE必须被敲除并且PEP羧化酶基因和/或丙酮酸羧化酶基因必须被引入本专利技术所述的微生物的基因组中。相应的途径和必需的突变例如被描述在Zhang等人(2009),PNAS(106)pp20180-20185中。因此,本专利技术的另一个实施方式是重组微生物，其相比于相应的参比微生物，包含引入的、增加的或增强的asd或gdhA基因活性和/或表达，所述asd或gdhA基因编码天冬氨酸-β-半醛脱氢酶或谷氨酸脱氢酶，并且其相比于相应的参比微生物，在发酵生产中具有更高的丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸和/或亮氨酸产率/或生产力。本专利技术的其它实施方式是重组微生物，其相比于相应的参比微生物，包含引入的、增加的或增强的asd和gdhA基因活性和/或表达，并且相比于相应的参比微生物，在发酵生产中具有更高的丙氨酸产率和/或生产力。在一些实施方式中,所述的微生物是原核细胞。合适的原核细胞包括革兰氏阳性的、革兰氏阴性的和革兰氏可变的细菌细胞,优选革兰氏阴性的。因此,可以用于本专利技术中的微生物包括但是不限于，氧化葡糖杆菌(Gluconobacteroxydans)、浅井氏葡糖杆菌(Gluconobacterasaii)、德尔马瓦无色杆菌(Achromobacterdelmarvae)、粘无色杆菌(Achromobacterviscosus)、乳无色杆菌(Achromobacterlacticum)、根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)、放射杆状土壤杆菌(Agrobacteriumradiobacter)、粪产碱菌(Alcaligenesfaecalis)、柠檬节杆菌(Arthrobactercitreus)、肿胀节杆菌(Arthrobactertumescens)、石蜡节杆菌(Arthrobacterparaffineus)、烃谷氨酸节杆菌(Arthrobacterhydrocarboglutamicus)、氧化节杆菌(Arthrobacteroxydans)、天牛金杆菌(Aureobacteriumsaperdae)、印度固氮菌(Azotobacterindicus)、产氨短杆菌(Brevibacteriumammoniagenes)、分叉短杆菌(Brevibacteriumdivaricatum)、乳酸发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)、黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)、球形短杆菌(Brevibacteriumglobosum)、暗褐短杆菌(Brevibacteriumfuscum)、酮戊二酸短杆菌(Brevibacteriumketoglutamicum)、微黄短杆菌(Brevibacteriumhelvolum)、极小短杆菌(Brevibacteriumpusillum)、砖红色短杆菌(Brevibacteriumtestaceum)、玫瑰色短杆菌(Brevibacteriumroseum)、Brevibacteriumimmariophilium、扩展短杆菌(Brevibacteriumlineus)、原玻璃蝇短杆菌(Brevibacteriumprotopharmiae)本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组微生物，其包含减小的、受抑制的或缺失的asd基因或gdhA基因活性和/或表达。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.06.12 US 62/174,529;2015.06.16 US 62/180,0811.一种重组微生物，其包含减小的、受抑制的或缺失的asd基因或gdhA基因活性和/或表达。2.根据权利要求1所述的重组微生物，其进一步包含引入的、增加的或增强的alaD基因活性和/或表达。3.根据权利要求1或2所述的重组微生物，其进一步包含减小的、受抑制的或缺失的pflB基因活性和/或表达。4.根据权利要求1至3中任一项所述的重组微生物，其进一步包含减小的、受抑制的或缺失的adhE基因活性和/或表达。5.根据权利要求1至4中任一项所述的重组微生物，其进一步包含减小的、受抑制的或缺失的ldhA基因活性和/或表达。6.根据权利要求1至5中任一项所述的重组微生物，其进一步包含减小的、受抑制的或缺失的pta基因和/或ackA基因活性和/或表达。7.根据权利要求1至6中任一项所述的重组微生物，其进一步包含减小的、受抑制的或缺失的frdA基因活性和/或表达。8.根据权利要求1至7中任一项所述的重组微生物，其进一步包含减小的、受抑制的或缺失的dadX基因活性和/或表达。9.根据权利要求1至8中任一项所述的重组微生物，其进一步包含引入的、增加的或增强的ygaW基因活性和/或表达。10.根据权利要求1至9中任一项所述的重组微生物，其进一步包含引入的、增加的或增强的zipA基因活性和/或表达。11.根据权利要求1至10中任一项所述的重组微生物，其进一步包含引入的、增加的或增强的lpd基因活性和/或表达。12.根据权利要求1至11中任一项所述的重组微生物，其进一步包含减小的、受抑制的或缺失的brnQ基因活性和/或表达。13.根据权利要求1至12中任一项所述的重组微生物，其进一步包含突变的lpxD基因。14.根据权利要求1至13中任一项所述的重组微生物，其进一步包含引入的、增加的或增强的gcvA基因活性和/或表达。15.根据权利要求1至14中任一项所述的重组微生物，其进一步包含减小的、受抑制的或缺失的gcvB基因活性和/或表达。16.根据权利要求1至15中任一项所述的重组微生物，其中asd基因或gdhA基因选自由下列组成的组:(i)包含SEQIDNO:25或SEQIDNO:37的序列的核酸分子,或(ii)与SEQIDNO:25或SEQIDNO:37的核酸分子具有至少80％同一性的核酸分子,或(iii)在严格条件下与具有SEQIDNO:25或SEQIDNO:37的核酸分子的互补序列杂交的核酸分子,或(iv)编码SEQIDNO:26或SEQIDNO:38的多肽的核酸分子，或(v)编码与SEQIDNO:26或SEQIDNO:38的多肽具有至少60％同源性的多肽的核酸分子。17.根据权利要求2至16中任一项所述的重组微生物，其中alaD基因选自由下列组成的组:(AA)包含SEQIDNO:1的序列的核酸分子,或(BB)与SEQIDNO:1的核酸分子具有至少80％同一性的核酸分子,或(CC)在严格条件下与具有SEQIDNO:1的核酸分子的互补序列杂交的核酸分子,或(DD)编码SEQIDNO:2的多肽的核酸分子,或(EE)编码与SEQIDNO:2的多肽具有至少60％同源性的多肽的核酸分子。18.根据权利要求3至17中任一项所述的重组微生物，其中pflB基因选自由下列组成的组:(A)包含SEQIDNO:5的序列的核酸分子,或(B)与SEQIDNO:5的核酸分子具有至少80％同一性的核酸分子,或(C)在严格条件下与具有SEQIDNO:5的核酸分子的互补序列杂交的核酸分子，或(D)编码SEQIDNO:6的多肽的核酸分子,或(E)编码与SEQIDNO:6的多肽具有至少60％同源性的多肽的核酸分子。19.根据权利要求4至18中任一项所述的重组微生物，其中adhE基因选自由下列组成的组:(F)包含SEQIDNO:7的序列的核酸分子,或(G)与SEQIDNO:7的核酸分子具有至少80％同一性的核酸分子,或(H)在严格条件下与具有SEQIDNO:7的核酸分子的互补序列杂交的核酸分子，或(I)编码SEQIDNO:8的多肽的核酸分子,或(J)编码与SEQIDNO:8的多肽具有至少60％同源性的多肽的核酸分子。20.根据权利要求5至19中任一项所述的重组微生物，其中ldhA基因选自由下列组成的组:(K)包含SEQIDNO:9的序列的核酸分子,或(L)与SEQIDNO:9的核酸分子具有至少80％同一性的核酸分子,或(M)在严格条件下与具有SEQIDNO:9的核酸分子的互补序列杂交的核酸分子，或(N)编码SEQIDNO:10的多肽的核酸分子,或(O)编码与SEQIDNO:10的多肽具有至少60％同源性的多肽的核酸分子。21.根据权利要求6至20中任一项所述的重组微生物，其中pta基因选自由下列组成的组:(P1)包含SEQIDNO:11的序列的核酸分子,或(Q1)与SEQIDNO:11的核酸分子具有至少80％同一性的核酸分子,或(R1)在严格条件下与具有SEQIDNO:11的核酸分子的互补序列杂交的核酸分子，或(S1)编码SEQIDNO:12的多肽的核酸分子,或(T1)编码与SEQIDNO:12的多肽具有至少60％同源性的多肽的核酸分子，并且其中ackA基因选自由下列组成的组:(P2)包含SEQIDNO:32的序列的核酸分子,或(Q2)与SEQIDNO:32的核酸分子具有至少80％同一性的核酸分子,或(R2)在严格条件下与具有SEQIDNO:32的核酸分子的互补序列杂交的核酸分子，或(S2)编码SEQIDNO:33的多肽的核酸分子,或(T1)编码与SEQIDNO:33的多肽具有至少60％同源性的多肽的核酸分子。22.根据权利要求7至21中任一项所述的重组微生物，其中frdA基因选自由下列组成的组:(U)包含SEQIDNO:13的序列的核酸分子,或(V)与SEQIDNO:13的核酸分子具有至少80％同一性的核酸分子,或(W)在严格条件下与具有SEQIDNO:13的核酸分子的互补序列杂交的...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·加特茨格，M·库马尔，M·D·布兰克施恩，S·S·拉塔尼，王庆昭，
申请(专利权)人：巴斯夫欧洲公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE