一种乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌制造技术

本发明专利技术公开了一种乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌，属于遗传工程领域。是以枯草芽孢杆菌BSGNKAP‑PxylA‑glmS‑P43‑GNA1为出发菌株，在基因组上整合强组成型启动子Pveg控制的磷酸酶yqaB基因，并将6‑磷酸氨基葡萄糖合酶的启动子替换为了强组成型启动子Pveg，得到了积累乙酰氨基葡萄糖枯草芽孢杆菌基因工程菌BSGNY‑Pveg‑glmS‑P43‑GNA1。3L发酵罐乙酰氨基葡萄糖产量达到60.5g/L，乙酰氨基葡萄糖得率为0.311g/g葡萄糖，生产强度为0.983g/L/h，实现了乙酰氨基葡萄糖在重组枯草芽孢杆菌胞外产量的提高，并为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产氨基葡萄糖奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
一种乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌
本专利技术涉及一种乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌的，属于遗传工程领域。
技术介绍
乙酰氨基葡萄糖是生物体内的一种单糖，广泛存在于细菌、酵母、霉菌、植物以及动物体内。在人体中，乙酰氨基葡萄糖是糖胺聚糖二糖单元的合成前体，其对修复和维持软骨及关节组织功能具有重要作用。因此，乙酰氨基葡萄糖被广泛作为药物和营养膳食添加来治疗和修复关节损伤。此外，乙酰氨基葡萄糖在化妆品领域也具有诸多应用。目前，乙酰氨基葡萄糖主要采用酸解虾壳或蟹壳中甲壳素生产，此方法产生的废液对环境污染较为严重，而且得到的产品易引起过敏反应，不适宜海鲜过敏的人群服用。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被FDA认证为“generallyregardedassafe”(GRAS)安全级别。因此，运用代谢工程手段构建重组枯草芽孢杆菌是生产食品安全级乙酰氨基葡萄糖的有效途径。然而，专利申请201510761678.6中构建的重组枯草芽孢杆菌(BSGNKAP-PxylA-glmS-P43-GNA1)存在产量不高、产物转化率较低的缺点。因此，提高乙酰氨基葡萄糖合成途径代谢通量，是提高乙酰氨基葡萄糖产量的亟待解决问题。因此，提高乙酰氨基葡萄糖合成途径代谢通量，是提高乙酰氨基葡萄糖产量亟待解决的问题。目前枯草芽孢杆菌中催化乙酰氨基葡萄糖合成途径的最后一步反应，即6-磷酸乙酰氨基葡萄糖转化为乙酰氨基葡萄糖的酶尚不清楚。据报道在酿酒酵母中表达来自于大肠杆菌的HAD-like家族的三个磷酸酶后对乙酰氨基葡萄糖的合成都有明显的促进作用；而以大肠杆菌作为宿主菌时只需强化6-磷酸氨基葡萄糖合酶glmS与6-磷酸氨基葡萄糖乙酰化酶基因GNA1便可达到很高的乙酰氨基葡萄糖产量，很可能是因为其周质空间中存在丰富的磷酸酶可以催化6-磷酸乙酰氨基葡萄糖转化为乙酰氨基葡萄糖。而枯草芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，其不存在大肠杆菌那样的周质空间结构，因此推测在重组枯草芽孢杆菌BSGNKAP-PxylA-glmS-P43-GNA1中6-磷酸乙酰氨基葡萄糖转化为乙酰氨基葡萄糖的反应可能为其合成乙酰氨基葡萄糖的限速步骤。枯草芽孢杆菌中有一些组成型启动子其表达强度不会受到环境因素的影响，其中启动子Pveg强度较强，具体参见文献GUIZIOUS等.AparttoolboxtotunegeneticexpressioninBacillussubtilis[J].NucleicAcidsResearch,2016,44(15):gkw624。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了一种高效合成乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌。本专利技术的第一个目的是提供一种乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌，所述重组枯草芽孢杆菌整合表达了磷酸酶基因yqaB，并强化表达6-磷酸氨基葡萄糖合酶基因glmS。在本专利技术的一种实施方式中，所述整合表达磷酸酶基因yqaB是以强组成型启动子Pveg控制磷酸酶基因yqaB表达，通过同源重组替换将其整合在基因组上。在本专利技术的一种实施方式中，所述磷酸酶基因yqaB表达的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。在本专利技术的一种实施方式中，强化表达6-磷酸氨基葡萄糖合酶基因glmS是将6-磷酸氨基葡萄糖合酶基因glmS的启动子PxylA替换为强组成型启动子Pveg。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌是以枯草芽孢杆菌BSGNKAP-PxylA-glmS-P43-GNA1为出发菌株。在本专利技术的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌BSGNKAP-PxylA-glmS-P43-GNA1是以枯草芽孢杆菌168为基础，基因型作如下改造得到的：ΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔldhΔptaΔglcKΔpckAΔpyk::lox72，并以木糖诱导启动子PxylA调控表达glmS、在质粒上以启动子P43调控表达GNA1的重组表达。在本专利技术的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌BSGNKAP，是申请号为201510761678.6的专利申请中构建的重组枯草芽孢杆菌BSGNKAP。在本专利技术的一种实施方式中，是以BSGNKAP-PxylA-glmS-P43-GNA1为出发菌株，通过同源重组在基因组nagAB位点以强启动子Pveg控制磷酸酶基因yqaB表达；并将6-磷酸氨基葡萄糖合酶基因glmS的启动子替换为强组成型启动子Pveg。本专利技术的第二个目的是提供上述重组枯草芽孢杆菌在药物、营养保健品或者化妆品中的应用。在本专利技术的一种实施方式中，所述应用是利用所述重组枯草芽孢杆菌生产乙酰氨基葡萄糖。在本专利技术的一种实施方式中，所述应用是将生产菌株活化后，以5-10％的接种量转入发酵培养基，35-38℃、500-900rpm条件下培养50-72h。本专利技术的有益效果：本专利技术通过过表达6-磷酸氨基葡萄糖糖合酶glmS，加强6-磷酸氨基葡萄糖糖合成的反应，细胞生长得到恢复，且乙酰氨基葡萄糖的产量及得率均有较大提高，解决了因强化反应后会竞争性的利用胞内细胞壁合成的前体物质6-磷酸氨基葡萄糖，从而导致的对细胞生长产生的不利影响。本专利技术提供的重组枯草芽孢杆菌可高效利用葡萄糖合成乙酰氨基葡萄糖，其在3L发酵罐上产量可达到60.5g/L，同时本专利技术提供的重组枯草芽孢杆菌3L发酵乙酰氨基葡萄糖得率为0.311g/g葡萄糖，生产强度为0.983/L/h，实现了乙酰氨基葡萄糖在重组枯草芽孢杆菌胞外产量的提高，并为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产氨基葡萄糖奠定了基础。附图说明图1为不同组成型启动子对调控yqaB表达的影响；图2为不同组成型启动子对调控glmS表达的影响。具体实施方式种子培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl10。摇瓶发酵培养基(g/L)：胰蛋白胨6，酵母粉12，(NH4)SO46，K2HPO4·3H2O12.5，KH2PO42.5，CaCO35，微量元素10ml/L；微量元素溶液按g/L计含有：MnSO4·5H2O1.0，CoCl2·6H2O0.4，NaMoO4·2H2O0.2，ZnSO4·7H2O0.2，AlCl3·6H2O0.1，CuCl2·H2O0.1，H3BO40.05，含5MHCl。上罐发酵培养基(g/L)：胰蛋白胨20，酵母粉20，K2HPO4·3H2O12.5，KH2PO42.5，CaCO35，微量元素10ml/L；微量元素溶液按g/L计含有：MnSO4·5H2O1.0，CoCl2·6H2O0.4，NaMoO4·2H2O0.2，ZnSO4·7H2O0.2，AlCl3·6H2O0.1，CuCl2·H2O0.1，H3BO40.05，含5MHCl。乙酰氨基葡萄糖的测定方法：高效液相色谱(HPLC)检测法：Agilent1260，RID检测器，HPX-87H柱(Bio-RadHercules,CA)，流动相：5mMH2SO4，流速0.6mL/min，柱温35℃，进样体积为10μL。乙酰氨基葡萄糖得率的计算：乙酰氨基葡萄糖得率(YGlcNAc/Glc)＝乙酰氨基葡萄糖产量(g/L)/消耗的葡萄糖(g/L)。实施例1：构建重组枯草芽孢杆菌BSGNY-PxylA-glm本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌整合表达了磷酸酶基因yqaB，并强化表达6‑磷酸氨基葡萄糖合酶基因glmS。

【技术特征摘要】
1.一种乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌整合表达了磷酸酶基因yqaB，并强化表达6-磷酸氨基葡萄糖合酶基因glmS。2.根据权利要求1所述重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述整合表达磷酸酶基因yqaB是以强组成型启动子Pveg控制磷酸酶基因yqaB表达，通过同源重组替换将其整合在重组枯草芽孢杆菌基因组上。3.根据权利要求2所述重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述磷酸酶基因yqaB表达的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。4.根据权利要求1所述重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，强化表达6-磷酸氨基葡萄糖合酶基因glmS是将6-磷酸氨基葡萄糖合酶基因glmS的启动子替换为强组成型启动子Pveg。5.根据权利要求1所述重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌是以枯草芽孢杆菌BSGNKAP-PxylA...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘龙，陈坚，堵国成，李江华，武耀康，陈泰驰，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32