3,7‑二羟基卓酚酮高产菌株及其发酵培养方法技术

本发明专利技术公开了3,7‑二羟基卓酚酮高产菌株及其发酵培养方法；本发明专利技术公开了两株通过生物合成基因簇克隆和异源表达的方式构建的天蓝色链霉菌M1152/pCXF1和M1154/pCXF1，能够生产大量的3,7‑二羟基卓酚酮，利用R3固体培养基培养产量可达606mg/L；比文献报道的3,7‑二羟基卓酚酮的产生菌Streptomyces tropolofaciens No.K611‑97(ATCC 53548)的产量(0.02mg/L)提高了约30,000倍。

【技术实现步骤摘要】
3,7-二羟基卓酚酮高产菌株及其发酵培养方法
本专利技术属于抗生素应用领域，具体涉及3,7-二羟基卓酚酮高产菌株及其发酵培养方法。
技术介绍
卓酚酮是一类具有2，4，6-环庚三烯酚酮七元芳香环结构的稀有天然产物，常见于植物与真菌中，在细菌中鲜有报道。Penicilliumstipitatum合成的Stipitaticacid与Thujaplicata及Chamaecyparistaiwanensis中合成的β-thujaplicin(hinokitiol)是真菌与植物中最早报道的这类具有稀有2，4，6-环庚三烯酚酮七元芳香环结构的天然产物；其中Stipitaticacid由HaroldRaistrik等于1942年首次发现并由MichaelDewar等于1945年对其结构进行了解析；同一时期Erdtman与TetsuoNozoe等分别对β-thujaplicin(Hinokitiol)的结构也进行了解析；从而揭示了一类非苯环七元环芳香化合物，掀起了这类天然产物的研究热潮。然而细菌中的卓酚酮直到上世纪80年代才首次在PseudomonasATCC31099中发现并报道，随后在Streptomycesneyagawaensis，BurkholdiaplantariiATCC43733以及StreptomycestropolofaciensNo.K611-97(ATCC53548)中也相继报道。但其产生菌产量并不高，前期报道的分离方法中，在208L发酵培养中仅分离到6mg化合物。3,7-二羟基卓酚酮具有非常好的抗革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性菌、分枝杆菌及真菌等广谱抗菌活性，同时还具有非常好的抗肿瘤尤其是B16黑色素瘤的活性以及抗病毒如艾滋病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)及疱疹病毒(HSV)等活性。3,7-二羟基卓酚酮因其特殊的α-羟基酮的结构，可以螯合金属离子，因而其可以发挥金属离子螯合剂的功能，抑制金属酶的活性。近年来通过对其结构进行改造以提高其生物活性的研究取得了长足的进展，卓酚酮的生产和其生物合成途径的研究也得到了广泛的关注。然而由于产量的限制和其生物合成基因簇的不确定性，极大地妨碍了卓酚酮的开发和利用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供3,7-二羟基卓酚酮高产菌株及其发酵培养方法；涉及3,7-二羟基卓酚酮分离纯化、产量鉴定、基因簇克隆、异源表达和抗性筛选。具体而言，本专利技术通过构建一株赭石菌核链霉菌B222(S.ochraceiscleroticusB222)的cosmid文库，通过LEXAS高通量异源表达筛选系统，筛选、克隆并异源表达了3,7-二羟基卓酚酮的生物合成基因簇，获得了3,7-二羟基卓酚酮的异源表达菌株天蓝色链霉菌M1152/pCXF1和天蓝色链霉菌M1154/pCXF1，并对上述两株菌的3,7-二羟基卓酚酮的产量进行检测。即本专利技术提供了两株3,7-二羟基卓酚酮的高产菌株，并提供了其分离纯化的方法，为卓酚酮的生产和纯化提供了有效的手段，并为其改造提供了依据。本专利技术中，所述天蓝色链霉菌M1152/pCXF1已于2017年3月23日递交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号为CGMCCNo.13914。所述天蓝色链霉菌M1154/pCXF1已于2017年3月23日递交CGMCC中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号为CGMCCNo.13916。所述空载体对照菌天蓝色链霉菌M1152/pJTU2554已于2017年3月23日递交CGMCC中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号为CGMCCNo.13915。所述空载体对照菌天蓝色链霉菌M1154/pJTU2554已于2017年3月23日递交CGMCC中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号为CGMCCNo.13917。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：第一方面，本专利技术涉及一株3,7-二羟基卓酚酮高产菌株，天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)M1152/pCXF1CGMCCNo.13914；该菌株含有碱基序列如SEQIDNO.1所示的3,7-二羟基卓酚酮的生物合成基因簇。第二方面，本专利技术涉及一株3,7-二羟基卓酚酮高产菌株，天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)M1154/pCXF1CGMCCNo.13916；该菌株含有碱基序列如SEQIDNO.1所示的3,7-二羟基卓酚酮的生物合成基因簇。第三方面，本专利技术涉及一种前述的菌株在生产3,7-二羟基卓酚酮中的用途。第四方面，本专利技术涉及一种前述的菌株的发酵培养方法，所述方法包括如下步骤：S1、MS培养基于28～30℃培养4～6天收集链霉菌孢子；S2、收集的孢子涂布R3培养基于28～30℃培养5～6天发酵积累3,7-二羟基卓酚酮。优选的，所述方法还包括3,7-二羟基卓酚酮的纯化步骤，如下：S3、将步骤S2中的R3发酵培养物利用乙酸乙酯(0.5％乙酸)进行浸提；S4、所获得的发酵产物萃取物，通过CHP20P大孔树脂分离纯化，用甲醇水进行梯度洗脱，洗脱梯度为40％甲醇/水，于室温静置过夜即可观察到大量3,7-二羟基卓酚酮结晶析出。优选的，所述方法还包括纯化后进行液相检测的步骤；所用分析用液相色谱柱为AgilentZorbaxSB-C18，检测仪器为Agilent1260Infinitysystem，流动相为：A相为添加1‰三氟乙酸的水相，B相为乙腈；洗脱条件为：0min，5％B；15min，40％B；25～30min，100％B；31～38min，5％B；流动相比例按体积比计算。第五方面，本专利技术涉及一种筛选3,7-二羟基卓酚酮产生菌的方法，所述方法包括如下步骤：在MS培养基上覆盖终浓度为18～20μg/ml的3,7-二羟基卓酚酮，在表面液体干燥后的平板上覆盖链霉菌孢子，于28～30℃培养4～6天，筛选出能够正常生长的链霉菌。本专利技术的原理在于：卓酚酮类化合物是一类具有稀有七元芳香环结构的次级代谢产物，具有非常好的抗菌、抗癌以及抗病毒的活性。通过化学合成不仅产率低，步骤繁琐，还需要高温高压，以及卤族元素等具有污染性的化合物的掺入。然而原先报道的生物合成3,7-二羟基卓酚酮产量很低，并且生物合成基因簇未见报导，需要寻找3,7-二羟基卓酚酮高产菌株，而链霉菌是次级代谢产物的主要来源，早期StreptomycestropolofaciensNo.K611-97(ATCC53548)菌中也有报道。本专利技术选择链霉菌作为筛选菌株。利用微生物次级代谢产物合成基因聚集成簇排列的特性，本专利技术利用LEXAS基因簇克隆和异源表达方法，构建得到能够异源表达其生物合成基因簇的基因工程菌株，由于不同菌株在不同的发酵培养基上次级代谢产物不尽相同，通过试验不同的菌株和培养基，利用天蓝色链霉菌背景干净、代谢前体充足的特性，构建了3,7-二羟基卓本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株3,7‑二羟基卓酚酮高产基因工程菌株，天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)M1152/pCXF1 CGMCC No.13914；该菌株含有碱基序列如SEQ ID NO.1所示的3,7‑二羟基卓酚酮的生物合成基因簇。

【技术特征摘要】
1.一株3,7-二羟基卓酚酮高产基因工程菌株，天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)M1152/pCXF1CGMCCNo.13914；该菌株含有碱基序列如SEQIDNO.1所示的3,7-二羟基卓酚酮的生物合成基因簇。2.一株3,7-二羟基卓酚酮高产基因工程菌株，天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)M1154/pCXF1CGMCCNo.13916；该菌株含有碱基序列如SEQIDNO.1所示的3,7-二羟基卓酚酮的生物合成基因簇。3.一种如权利要求1或2所述的菌株在生产3,7-二羟基卓酚酮中的用途。4.一种如权利要求1或2所述的菌株的发酵培养方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：S1、MS培养基于28～30℃培养4～6天收集链霉菌孢子；S2、收集的孢子涂布R3培养基于28～30℃培养5～6天发酵积累3,7-二羟基卓酚酮。5.如权利要求4所述的菌株的发酵培养方法，其特征在于，所述方法还包括3,7-二羟基卓酚酮的纯化步骤，如...

【专利技术属性】
技术研发人员：陶美凤，陈雪斐，徐敏，王业民，邓子新，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海,31