重组鼠伤寒沙门菌二价疫苗株的构建方法及所得株和应用技术

本发明专利技术提供了一种重组鼠伤寒沙门菌二价疫苗株的构建方法，其包括步骤：以鼠伤寒沙门菌ATCC14028为基础菌株，通过自杀质粒pRE112介导的同源重组法，构建缺失asd、crp和rfbN基因的菌株；通过Gibson组装的方法将纽波特沙门菌ATCC 27869的O‑抗原基因簇部分基因片段wzx‑wbaR‑wbaL‑wbaQ‑wzy‑wbaW‑wbaZ与含T1T2终止子、pSC101 origin、asd基因表达盒、Amp抗性基因盒和Ptrc启动子的DNA骨架片段进行融合连接，构建Asd+质粒pCZ11‑1；将所得Asd+质粒pCZ11‑1转入上述所得菌株，即得。本发明专利技术构建得到的重组鼠伤寒沙门菌二价疫苗株具有高水平的针对同源LPS和异源LPS的血清IgG应答，对同源强毒株—鼠伤寒沙门菌ATCC14028和异源强毒株—纽波特沙门菌SLN06具有100％的免疫保护效率。

【技术实现步骤摘要】
重组鼠伤寒沙门菌二价疫苗株的构建方法及所得株和应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种重组鼠伤寒沙门菌二价疫苗株的构建方法及所得株和应用。
技术介绍
非伤寒沙门菌(Not-typhoidalSalmonella)能够引起人类、哺乳类、鸟类、爬行类等多种动物的食物源性人畜共患病，对公共卫生安全造成了重要威胁。据统计，全世界每年超过9000万人感染NTS而引发肠胃炎，并造成至少15万人的死亡。此外，NTS还能引起全球范围内的免疫缺陷病人或非洲地区人群的系统性感染，引发菌血症、败血症及脑膜炎等，死亡率较高。接触受污染的动物产品，如鸡蛋、肉制品等是人感染沙门菌的重要途径，因而控制沙门菌在动物与人类间的传播是沙门菌病防控的关键。NTS血清型多达上千种，然而据研究，在人类和动物中流行的血清型主要是鼠伤寒沙门菌(SalmonellaTyphimurium)、肠炎沙门菌和血清群C沙门菌(如纽波特沙门菌、猪霍乱沙门菌、婴儿沙门菌等)。疫苗是控制疾病最经济有效的手段，随着沙门菌耐药现象日益严重，人们意识到一种能够预防多种血清型的沙门菌多价疫苗是防控动物和人类非伤寒沙门菌病的迫切需求。然而，目前尚无应用于人类的非伤寒沙门菌疫苗，开发的商品化动物用疫苗均为单价疫苗，交叉免疫保护力不足。因此，本领域亟需可解决上述问题的技术出现。
技术实现思路
针对现有技术的缺点，本专利技术的目的之一在于提供一种重组鼠伤寒沙门菌二价疫苗株的构建方法，该方法包括如下步骤：(1)以鼠伤寒沙门菌ATCC14028为基础菌株，通过自杀质粒pRE112介导的同源重组法，构建同时缺失asd、crp和rfbN三个基因的菌株；(2)通过Gibson组装的方法将纽波特沙门菌ATCC27869的O-抗原基因簇部分基因片段wzx-wbaR-wbaL-wbaQ-wzy-wbaW-wbaZ与含T1T2终止子、pSC101origin、asd基因表达盒、Amp抗性基因盒和Ptrc启动子的DNA骨架片段进行融合连接，构建Asd+质粒pCZ11-1；所述wzx-wbaR-wbaL-wbaQ-wzy-wbaW-wbaZ的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示；(3)将步骤(2)所得Asd+质粒pCZ11-1转入步骤(1)所得菌株，即得所述重组鼠伤寒沙门菌二价疫苗株；所述重组鼠伤寒沙门菌二价疫苗株具有高水平的针对同源LPS和异源LPS的血清IgG应答，对同源强毒株—鼠伤寒沙门菌ATCC14028和异源强毒株—纽波特沙门菌具有100％的免疫保护效率；所述纽波特沙门菌对于BALB/C小鼠的LD50为2x107CFU。步骤(1)中，设计6对引物分别缺失鼠伤寒沙门菌ATCC14028菌株的rfbN、asd和crp三个基因，突变顺序为asd、crp、rfbN；进行利用自杀质粒pRE112介导的同源重组操作时，利用所述6对引物分别对asd、crp和rfbN基因的上、下游同源臂进行扩增和融合，得到融合片段，再对融合片段和质粒pRE112进行酶切和连接处理；所述6对引物的序列如下：优选的，扩增所述上、下游同源臂时，反应体系为：模板DNA1μl，2×primeSTARMax25μl，上游引物1μl，上游引物1μl，ddH2O22μl；扩增条件为：94℃变性2min后进入循环，循环参数为94℃10sec，55℃15sec，72℃10sec。30个循环后，72℃延伸8min。进行所述融合处理时，将上下游同源臂按照摩尔数1:1的比例混合，取其中2μl作为模板，然后利用相应引物和高保真酶primeSTARMax进行PCR扩增，得到融合片段。进行所述酶切和连接处理时，方法为：分别用KpnI和XmaI酶酶切融合片段和pRE112质粒，将融合片段和质粒酶切出互补粘性末端，并回收质粒和片段；利用T4DNA连接酶将酶切后的融合片段与pRE112质粒连接，16℃，过夜，转化λ，过夜大肠杆菌感受态细胞SM10中，待其长出后进行PCR鉴定，获得阳性重组自杀质粒pRE112。构建Asd+质粒pCZ11-1时，以纽波特沙门菌ATCC27869基因组为模板，利用引物C2-F/C2-R扩增获得7547bp的wzx-wbaR-wbaL-wbaQ-wzy-wbaW-wbaZ序列片段；以pCZb1-1质粒为模板，利用引物C2-VEC-F/C2-VEC-R扩增获得5306bp的包括T1T2终止子、pSC101origin、asd基因表达盒、Amp抗性基因盒和Ptrc启动子的DNA骨架片段；上述引物的序列为：本专利技术的另外一个目的在于提供由上述构建方法构建得到的重组鼠伤寒沙门菌二价疫苗株，该疫苗株具有高水平的针对同源LPS和异源LPS的血清IgG应答，对同源强毒株—鼠伤寒沙门菌ATCC14028和异源强毒株—纽波特沙门菌具有100％的免疫保护效率，所述纽波特沙门菌对于BALB/C小鼠的LD50为2×107CFU；；所述疫苗株的分类命名为肠沙门氏菌Salmonellaenterica，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.14477，保藏时间为2017年07月31日。中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编为100101。本专利技术的另外一个目的在于提供上述疫苗株在预防鼠伤寒沙门菌和/或纽波特沙门菌的感染方面的应用。如何快速简单地构建多糖表达质粒且使其在沙门菌体内稳定地表达，如何选择突变使疫苗载体阻断同源O抗原的表达并提升异源O-抗原的表达，是研究多糖重组疫苗的关键。本专利技术以鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028为载体，先构建鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028基因缺失株(ΔasdΔcrp)并以其做为载体，以宿主-质粒平衡致死系统为技术基础，先通过缺失减毒株O-多糖基因簇rfbN基因以阻断同源O抗原多糖的表达；再利用Gibson组装试剂盒将包含T1T2终止子、pSC101origin、asd基因表达盒、Amp抗性基因盒和Ptrc启动子的DNA片段(来源于质粒pCZb1-1)与纽波特沙门菌O-抗原基因簇的部分基因wzx-wbaR-wbaL-wbaQ-wzy-wbaW-wbaZ(下简称wzx-wbaZ)进行克隆连接，构建重组表达纽波特沙门菌O-抗原的Asd+重组质粒pCZ11-1；然后将重组质粒导入缺失rfbN基因和保留rfbN基因的减毒鼠伤寒沙门菌菌株中，构建新颖的沙门菌二价疫苗株，以之来同时预防纽波特沙门菌和鼠伤寒沙门菌在动物上的侵染。本专利技术为研制沙门菌或其他细菌多价疫苗提供了新策略。本专利技术的有益效果：本专利技术构建得到的重组鼠伤寒沙门菌二价疫苗株具有高水平的针对同源LPS和异源LPS的血清IgG应答，对同源强毒株—鼠伤寒沙门菌ATCC14028和异源强毒株—纽波特沙门菌SLN06具有100％的免疫保护效率。附图说明图1为沙门菌rfbN突变株PCR鉴定图；其中，泳道1：ATCC14028菌株；泳道2：rfbN突变株。M：DNAMarker；图2为构建Asd+质粒pCZ11-1时片段的扩增结果图；其中，泳道1：利用引物C2-F/C2-R扩增wzx-wbaZ序列，泳道2：利用引物C2-VEC-F/C2-VEC-R扩增获得5309bp的DNA骨架片段(包括本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组鼠伤寒沙门菌二价疫苗株的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)以鼠伤寒沙门菌ATCC14028为基础菌株，通过自杀质粒pRE112介导的同源重组法，构建同时缺失asd、crp和rfbN三个基因的菌株；(2)通过Gibson组装的方法将纽波特沙门菌ATCC 27869的O‑抗原基因簇部分基因片段wzx‑wbaR‑wbaL‑wbaQ‑wzy‑wbaW‑wbaZ与含T1T2终止子、pSC101origin、asd基因表达盒、Amp抗性基因盒和Ptrc启动子的DNA骨架片段进行融合连接，构建Asd

【技术特征摘要】
1.一种重组鼠伤寒沙门菌二价疫苗株的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)以鼠伤寒沙门菌ATCC14028为基础菌株，通过自杀质粒pRE112介导的同源重组法，构建同时缺失asd、crp和rfbN三个基因的菌株；(2)通过Gibson组装的方法将纽波特沙门菌ATCC27869的O-抗原基因簇部分基因片段wzx-wbaR-wbaL-wbaQ-wzy-wbaW-wbaZ与含T1T2终止子、pSC101origin、asd基因表达盒、Amp抗性基因盒和Ptrc启动子的DNA骨架片段进行融合连接，构建Asd+质粒pCZ11-1；所述wzx-wbaR-wbaL-wbaQ-wzy-wbaW-wbaZ的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示；(3)将步骤(2)所得Asd+质粒pCZ11-1转入步骤(1)所得菌株，即得所述重组鼠伤寒沙门菌二价疫苗株；所述重组鼠伤寒沙门菌二价疫苗株具有高水平的针对同源LPS和异源LPS的血清IgG应答，对同源强毒株—鼠伤寒沙门菌ATCC14028和异源强毒株—纽波特沙门菌具有100％的免疫保护效率；所述纽波特沙门菌对于BALB/C小鼠的LD50为2×107CFU。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，设计6对引物分别缺失鼠伤寒沙门菌ATCC14028菌株的rfbN、asd和crp三个基因，突变顺序为asd、crp、rfbN；进行利用自杀质粒pRE112介导的同源重组操作时，利用所述6对引物分别对asd、crp和rfbN基因的上、下游同源臂进行扩增和融合，得到融合片段，再对融合片段和质粒pRE112进行酶切和连接处理；所述6对引物的序列如下：DrfbN1FCGGGGTACCGTATGTGGTCGTACTGACDrfbN1RTTTGACGAAGTTATTTTGATTCCGCCAACCDrfbN2FATCAAAATAACTTCGTCAAAAGAGATAAAATAAATG3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，扩增所述上、下游同源臂时，反应体系为：模板DNA1μl，2×primeSTARMax25μl，上游引物1μl，上游引物1μl，ddH2O22μl；扩增条件为：94℃变性2min后进入循环，循环参数为94℃10sec，55℃15sec，72℃10sec。30个循环后，72℃延伸8min。4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，进行所述融合处理时，将上下游同源臂按照摩尔数1:1的比例混合，取其中2μl作为模板，然后利用相应引物和高保真酶primeSTARMax进行PCR扩增，得到融合片段。5.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，进行所述酶切和连接处理时，方法为：分别用KpnI和XmaI酶酶切融合片段和pRE112质粒，将融合片段和质粒酶切出互补粘性末端，并回收质粒和...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵新新，程安春，代勤龙，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川,51