一种提高枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡萄糖产量的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡萄糖产量的方法，属于基因工程技术领域。本发明专利技术是以重组枯草芽孢杆菌(SGN6‑PxylA‑glmS‑P43‑GNA1)作为出发菌株，通过同源重组将glmS核酶分别整合至glmM基因和pfkA基因的rbs序列与其启动子序列中间，利用glmS核酶突变体具有延长mRNA的稳定性，将其整合至pgi基因的rbs序列与启动子序列之间，使重组表达后的菌株乙酰氨基葡萄糖的产量达到11.79～20.05g/L，为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产氨基葡萄糖奠定了基础。

A method for improving the yield of acetylglucosamine in Bacillus subtilis

【技术实现步骤摘要】
一种提高枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡萄糖产量的方法
本专利技术涉及一种提高枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡萄糖产量的方法，属于基因工程

技术介绍
乙酰氨基葡萄糖是生物体内的一种单糖，广泛存在于细菌、酵母、霉菌、植物以及动物体内。在人体中，乙酰氨基葡萄糖是糖胺聚糖二糖单元的合成前体，其对修复和维持软骨及关节组织功能具有重要作用。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被FDA认证为“generallyregardedassafe”(GRAS)安全级别。因此，运用代谢工程手段构建重组枯草芽孢杆菌是生产食品安全级乙酰氨基葡萄糖的有效途径。以往构建的重组枯草芽孢杆菌(S5-PxylA-glmS-P43-GNA1)在发酵培养基中乙酰氨基葡萄糖产率相对较低。已有研究表明，6-磷酸果糖在GlmS的催化作用下生成6-磷酸氨基葡萄糖(GlcN6P)的过程受到由glmS核酶开关介导的严格反馈控制，该步是GlcNAc合成途径中的重要限速反应，具体调控过程如下：当胞内GlcN6P积累时，其能够与glmS核酶开关结合，激活核酶开关对glmS基因转录产物进行自切割；3’端mRNA切割部分因切割形成的5’-OH端被RNA酶J1特异性识别，在RNA酶J1作用下mRNA被进一步降解，造成glmS基因的mRNA无法翻译，降低glmS基因的表达；而当GlcN6P浓度较低时，glmS基因转录产物可正常翻译。但是，当glmS核酶的断裂位点由AG突变为CC碱基，其断裂活性明显下降，其转录产物半衰期明显增强，gmS核酶突变体(断裂位点AG突变为CC)能够增强报告基因GFP的表达。在B.subtilis中GlcNAc代谢网络可以分为GlcNAc合成模块、中心代谢模块(6-磷酸果糖激酶PFK是该模块关键酶)和肽聚糖合成模块(磷酸氨基葡萄糖变位酶GlmM是该模块关键酶)，而中心代谢模块和肽聚糖合成模块是GlcNAc合成模块的竞争模块。要实现GlcNAc的高效合成，需要在强化GlcNAc合成模块的同时弱化中心代谢模块和肽聚糖合成模块，而由于中心代谢模块和肽聚糖合成模块是细胞生长所必须的，只能在细胞生长过程中进行弱化表达。目前，常用的弱化基因表达的策略主要是启动子工程、RBS工程和基因敲除；但是这些策略通常会产生一些不良性状，如中间产物抑制，积累毒性代谢中间产物，目的产物合成效率低，影响细胞生长等。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种产乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌，该基因工程菌利用glmS核酶和/或其突变体调控基因表达；所述调控基因表达是抑制glmM和pfkA基因的表达，并增强pgi基因的表达。在本专利技术的一种实施方式中，所述调控基因表达是在高浓度GlcN6P的情况下，加快glmS核酶断裂速度，增强对pfkA和glmM抑制效果；在低浓度GlcN6P的情况下，减弱glmS核酶激活效果，使glmS核酶断裂速度变慢，减弱pfkA和glmM的抑制效果。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因工程菌是将编码氨基葡萄糖合成酶的基因glmS的核酶基因分别插入到glmM、pfkA基因的rbs序列和启动子序列之间，并将编码glmS核酶突变体的基因插入到pgi基因的rbs序列和启动子序列之间。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因工程菌以枯草芽孢杆菌为宿主细胞。在本专利技术的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌为Bacillussubtilis168。在本专利技术的一种实施方式中，所述编码氨基葡萄糖合成酶的基因glmS的核酶基因序列如GeneID:8302932所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述编码glmS核酶突变体的基因序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术的第二个目的是提供一种构建上述重组枯草芽孢杆菌的方法。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法是将重组枯草芽孢杆菌S5-PxylA-glmS-P43-GNA1氨基葡萄糖合成酶基因glmS的核酶编码基因分别插入到glmM、pfkA基因的rbs序列和启动子序列之间；同时将glmS核酶突变体编码基因插入到pgi基因的rbs序列和启动子序列之间构建而成的重组枯草芽孢杆菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法的具体步骤为：(1)构建氨基葡萄糖合成酶基因glmS核酶编码基因整合框，通过同源重组将敲除框(glmM上游同源臂-筛选标记spc基因片段-glmS核酶基因片段-glmM下游同源臂)中的壮观霉素抗性基因spc、glmS核酶编码基因插入到重组枯草芽孢杆菌基因组中氨基葡萄糖磷酸变位酶(glmM)基因的rbs序列与启动子序列之间；(2)通过同源重组将敲除框(pfkA上游同源臂-筛选标记spc基因片段-glmS核酶基因片段-pfkA下游同源臂)中的壮观霉素抗性基因spc、glmS核酶编码基因插入到重组枯草芽孢杆菌基因组中6-磷酸果糖激酶(pfkA)基因的rbs序列与启动子序列之间；(3)构建氨基葡萄糖合成酶基因glmS核酶突变体-编码基因整合框，通过同源重组将敲除框(pgi上游同源臂-筛选标记spc基因片段-glmS核酶基因片段-pgi下游同源臂)中的壮观霉素抗性基因spc、glmS核酶突变体编码基因插入到重组枯草芽孢杆菌基因组中葡萄糖磷酸异构酶(pgi)基因的rbs序列与启动子序列之间。本专利技术的第三个目的是提供一种提高乙酰氨基葡萄糖产量的方法，所述方法是在含有乙酰氨基葡萄糖代谢途径的微生物中，将编码氨基葡萄糖合成酶的基因glmS的核酶基因分别插入到glmM、pfkA基因的rbs序列和启动子序列之间，并将编码glmS核酶突变体的基因插入到pgi基因的rbs序列和启动子序列之间。在本专利技术的一种实施方式中，所述编码氨基葡萄糖合成酶基因glmS核酶基因序列如GeneID:8302932所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述编码glmS核酶突变体的基因序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术的第四个目的是提供一种乙酰氨基葡萄糖的生产方法，是将所述基因工程菌接种至培养基中，于37℃培养72h。在本专利技术的一种实施方式中，所述培养基的成分包括(按g/L计)：葡萄糖100.0，磷酸氢二钾12.5，磷酸二氢钾2.5，硫酸铵6，蛋白胨6，酵母粉12.0，硫酸镁3，以及10mL/L的微量元素溶液。在本专利技术的一种实施方式中，所述微量元素溶液含有(按g/L计)：硫酸锰1.0，氯化钴0.4，钼酸钠0.2，硫酸锌0.2，氯化铝0.1，氯化铜0.1，硼酸0.05。本专利技术还提供所述基因工程菌在生产含乙酰氨基葡萄糖的产品中的应用。有益效果：本专利技术，通过氨基葡萄糖-6-磷酸反馈抑制glmS核酶，进而调控glmM和pfkA两个基因的表达，并利用glmS核酶突变体增强pgi基因的表达，实现乙酰氨基葡萄糖产量的提高。本专利技术提供的重组枯草芽孢杆菌可提高乙酰氨基葡萄糖的产量，其浓度最高可达到20.05g/L，相比于出发菌株提高了63.9％，为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产氨基葡萄糖奠定了基础。本专利技术提供的重组枯草芽孢杆菌构建方法简单，便于使用，具有很好地应用前景。附图说明图1为利用glmS核酶控制不同代谢位点对细胞生长和GlcNAc产生的影响结果；在发酵培养基中，图1a为不同菌株的细胞生长情况；图1b为不同菌株GlcNAc滴度的比较结果；图1c本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种产乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌，其特征在于，该基因工程菌以合成乙酰氨基葡萄糖的菌株为出发菌株，利用glmS核酶和/或其突变体调控基因表达；所述调控基因表达是抑制glmM和pfkA基因的表达，并增强pgi基因的表达。

【技术特征摘要】
1.一种产乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌，其特征在于，该基因工程菌以合成乙酰氨基葡萄糖的菌株为出发菌株，利用glmS核酶和/或其突变体调控基因表达；所述调控基因表达是抑制glmM和pfkA基因的表达，并增强pgi基因的表达。2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是将编码氨基葡萄糖合成酶的基因glmS的核酶基因分别插入到glmM、pfkA基因的rbs序列和启动子序列之间，并将编码glmS核酶突变体的基因插入到pgi基因的rbs序列和启动子序列之间。3.根据权利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于，glmS核酶基因的核苷酸序列如GeneID:8302932所示。4.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，编码glmS核酶突变体的基因序列如SEQIDNO.1所示。5.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，以枯草芽孢杆菌为宿主细胞。6.一种构建权利要求5所述基因工程菌的方法，其特征在于，通过同源重组将重组枯草芽孢...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘龙，李江华，牛腾飞，陈坚，堵国成，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32