生产醇的方法技术

提供了能够生产至少一种高级醇的微生物细胞，其中所述细胞被遗传修饰以包含至少一种酰基‑CoA还原酶(E11)相对于其野生型细胞的增加的表达。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】生产醇的方法专利
本专利技术涉及从碳源生产高级醇的生物技术方法。具体而言，该方法使用重组细胞用于从碳源生产高级醇。专利技术背景丁醇和高级醇具有几种用途，包括用作燃料。例如，在未来，丁醇可以代替汽油，因为这两种燃料的能量含量几乎相同。此外，与例如乙醇相比，作为替代燃料的丁醇具有几种其他优异的特性。这些包括，与乙醇相比，丁醇具有较高的能量含量，较少“挥发”且易于运输。与汽油相比，丁醇也被认为较少“挥发”。由于这些原因和更多原因，丁醇和/或相关的高级醇已经存在目前的潜在市场。丁醇和其他高级醇也被用作工业溶剂。高级醇也用于香水和化妆品工业中。例如，己醇通常用于香水工业中。目前，丁醇和其他高级醇主要从石油制造。这些化合物是通过裂化汽油或石油而获得，这是对环境有害的。此外，由于这些起始材料的成本将与石油价格相关(未来石油价格预期上涨)，因此相对于石油价格的上涨，丁醇和其他高级醇的价格可能也将上涨。因此，本领域需要找到高级醇生产的替代来源。在历史上(1900年代-1950年代)，生物丁醇在发酵过程中由玉米和糖蜜制造，所述发酵过程还产生丙酮和乙醇，并且通常与某些生产丁醇的细菌诸如丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)和拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)一起被称为ABE(丙酮、丁醇、乙醇)发酵。这种方法最近再次获得流行，在绿色能源中重新产生兴趣。然而，“玉米淀粉丁醇生产”过程需要大量的耗能步骤，包括农业玉米-作物栽培、玉米-谷物收获、玉米-谷物淀粉加工和淀粉至糖至丁醇发酵。“玉米淀粉丁醇生产”过程也可能消耗几乎与其产物丁醇的能量值一样多的能量。Alfol®醇方法是一种用于使用有机铝催化剂从乙烯生产高级醇的方法。该反应产生直长链伯醇(C2-C28)。该方法使用铝催化剂来使乙烯寡聚化并使所得烷基被氧化。然而，这种方法产生了广谱的醇，并且维持分布模式。这种恒定的模式限制了生产者只生产需求量最大或具有最高经济价值的特定醇范围的能力。另外，反应中所需的气体必须非常干净，并且需要有独特的气体组成来成功地进行反应。WO2009100434也描述了从碳水化合物生产丁醇和己醇的间接方法。该方法包括产同质乙酸发酵(homoacetogenicfermentation)以产生乙酸中间体，其然后化学转化为乙醇。然后将乙醇和乙酸中间体的剩余部分用作产酸发酵中的底物以产生丁酸和己酸中间体，然后将其化学转化为丁醇和己醇。然而，该方法使用昂贵原材料诸如碳水化合物，并且具有两个额外的工艺步骤，酯的形成和酯的化学氢化，这使得该方法不仅更长，而且导致沿途有用材料的损失。Perez,J.M.,2012公开了在合成气存在的情况下使用扬氏梭菌(Clostridiumljungdahlii)将短链羧酸转化成其相应的醇的方法。然而，必须添加短链羧酸作为转化为相应高级醇的底物。因此，目前可用的高级醇生产方法具有在气态底物向发酵液的质量转移中的限制，低生产率，和低终产物浓度，导致产品纯化的较高能源成本。因此，除了纯基于石油或基于玉米的来源之外，还希望找到更可持续的原材料作为经由生物技术方式的丁醇和其他高级醇生产的原料，所述生物技术方式也对环境引起较小的损害。具体而言，需要从可持续的原材料简单且有效地一锅式(one-pot)生物技术生产丁醇和其它高级醇。专利技术描述本专利技术提供了已遗传修饰以生产至少一种高级醇的细胞。具体而言，所述细胞可能够将乙醇和/或乙酸转化为至少一种高级醇。即，所述细胞可以被遗传修饰以相对于野生型细胞更高的表达水平表达酰基-CoA还原酶。这是有利的，因为可以使用单一细胞来从非基于石油的来源诸如乙醇和/或乙酸生产高级醇。而且，使用重组细胞使得生产高级醇的方法更有效。根据本专利技术的一个方面，提供了能够生产至少一种高级醇的微生物细胞，其中所述细胞被遗传修饰以包含至少一种酰基-CoA还原酶(E11)(EC.1.2.1.10)相对于其野生型细胞的增加表达。如本文中与细胞或微生物结合使用的短语“野生型”可以表示具有野生中天然看到的形式的基因组组成的细胞。该术语可能适用于整个细胞和个别基因两者。因此，术语“野生型”还可以包括已在其他方面(即，关于一个或多个基因)、但不与目标基因相关进行遗传修饰的细胞。因此，术语“野生型”不包括此类细胞或此类基因，其中已经使用重组方法人工至少部分改变特定目标基因的基因序列。因此，根据本专利技术的任何方面的野生型细胞是指就全基因组和/或特定基因而言没有基因突变的细胞。因此，在一个实例中，关于酶E1的野生型细胞可以是指细胞中具有酶E1的天然/未改变表达的细胞。关于酶E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8、E9、E10、E11、E12a、E12b、E13等的野生型细胞可以相同方式解释，并且可以是指细胞中分别具有酶E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8、E9、E10、E11、E12a、E12b、E13等的天然/未改变表达的细胞。技术人员将能够使用本领域已知的任何方法来遗传修饰的细胞或微生物。根据本专利技术的任何方面，遗传修饰的细胞可以被遗传修饰，使得在限定的时间间隔内，在2小时内，特别是在8小时或24小时内，其形成的乙酰乙酸和/或3-羟基丁酸为野生型细胞的至少2倍，尤其至少10倍、至少100倍、至少1000倍或至少10000倍。产物形成的增加可以通过例如在相同条件（相同细胞密度、相同营养培养基、相同培养条件）下在合适营养培养基中各自分开地培养根据本专利技术的任何方面的细胞和野生型细胞确定的时间间隔，并然后测定营养培养基中目标产物（高级醇）的量来确定。遗传修饰的细胞或微生物可以与野生型细胞或微生物在遗传上不同。根据本专利技术的任何方面的遗传修饰的微生物与野生型微生物之间的遗传差异可以是在遗传修饰的微生物中存在可能在野生型微生物中不存在的完整基因、氨基酸、核苷酸等。在一个实例中，根据本专利技术的任何方面的遗传修饰的微生物可包含使微生物能够生产高级醇的酶。相对于本专利技术的遗传修饰的微生物的野生型微生物可以不具有或不具有可检测到的使得遗传修饰的微生物能够生产至少一种高级醇的酶的活性。如本文所用，术语‘遗传修饰的微生物’可以与术语‘遗传修饰的细胞’互换使用。根据本专利技术的任何方面的遗传修饰可以在微生物的细胞上进行。根据本领域已知的任何方法遗传转化根据本专利技术的任何方面的细胞。具体而言，可以根据WO/2009/077461中公开的方法产生细胞。如本文所用，短语‘遗传修饰的细胞与其野生型相比具有增加的酶活性’是指相应酶的活性增加到至少2倍，特别是至少10倍，更特别是至少100倍，还更特别是至少1000倍，且甚至更特别是至少10000倍。如本文所用的短语‘增加的酶活性’应理解为增加的细胞内活性。基本上，通过增加编码酶的一个或多个基因序列的拷贝数、使用强启动子或利用编码具有增加的活性的相应酶的基因或等位基因并任选地通过结合这些措施可以实现酶促活性的增加。用于根据本专利技术的方法中的遗传修饰的细胞例如通过用含有所需基因、该基因的等位基因或其部分的载体和使得基因可以表达的载体转化、转导、接合或这些方法的组合来生产。异源表达特别通过将基因或等位基因整合到细胞染色体或染色体外复制载体中来实现。“酶的增加活性”可以与酶的过表达互换使用。根据本本文档来自技高网...

【技术保护点】
能够生产至少一种高级醇的微生物细胞，其中所述细胞被遗传修饰以包含至少一种酰基‑CoA还原酶(E11)相对于其野生型细胞的增加的表达，且其中所述细胞能够使用乙醇‑羧酸发酵生产羧酸和/或其酯。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.06.30 EP 15174527.01.能够生产至少一种高级醇的微生物细胞，其中所述细胞被遗传修饰以包含至少一种酰基-CoA还原酶(E11)相对于其野生型细胞的增加的表达，且其中所述细胞能够使用乙醇-羧酸发酵生产羧酸和/或其酯。2.根据权利要求1所述的细胞，其中所述细胞表达至少一种选自以下的酶：醇脱氢酶E1、乙醛脱氢酶E2、乙酰乙酰-CoA硫解酶E3、3-羟基丁酰基-CoA脱氢酶E4、3-羟基丁酰基-CoA脱水酶E5、丁酰基-CoA脱氢酶E6、电子转移黄素蛋白亚基E7、辅酶A转移酶E8、乙酸激酶E9、磷酸转乙酰酶E10。3.根据权利要求1或2所述的细胞，其中所述细胞来自选自克氏梭菌(Clostridiumkluyveri)和食一氧化碳梭菌(C.carboxidivorans)的微生物。4.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中酰基-CoA还原酶(E11)能够催化下面的反应1和/或反应2(a)：反应1：酰基-CoA+2NAD(P)H→脂肪醇反应2(a)：丁酰基-CoA+NAD(P)H-->丁醛+CoA+NAD(P)+。5.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中E11来自拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)。6.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中E11包含与SEQIDNO:1的60％序列同一性。7.根据前述权利要求中任一...

【专利技术属性】
技术研发人员：T哈斯，A赫克，S吉尔希，T比尔特，
申请(专利权)人：赢创德固赛有限公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE