真正的胰腺祖细胞的分离制造技术

本发明专利技术涉及用于分离真正的胰腺祖细胞和富集细胞群体的真正胰腺祖细胞的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】真正的胰腺祖细胞的分离专利
本专利技术涉及用于分离真正的胰腺祖细胞的方法。专利技术背景胰岛素依赖性糖尿病的细胞疗法治疗得利于不限数量的胰腺细胞的产生，所述胰腺细胞能够并且将能够发挥类似于人胰岛的作用。因此，需要生产衍生自人胚胎干(hES)细胞的这些胰腺细胞类型，以及纯化这些细胞的可靠方法。例如，使用衍生自人胚胎干细胞(hESC)的产生胰岛素的β细胞相比使用来自供体胰腺的细胞的当前细胞治疗方法将提供巨大的改善。目前，利用来自供体胰腺的细胞的糖尿病(例如1型或2型糖尿病)的细胞疗法治疗受限于移植所需的高质量胰岛细胞的稀缺。例如，针对单个1型糖尿病患者的细胞治疗需要移植大约8×108个胰岛细胞(Shapiroetal,2000,NEnglJMed343:230-238；Shapiroetal,2001a,BestPractResClinEndocrinolMetab15:241-264；Shapiroetal,2001b,BritishMedicalJournal322:861)。因此，需要至少两个健康的供体器官来获得足够的胰岛细胞用于成功移植。因此，胚胎干(ES)细胞代表了一个强大的模型系统，用于调查早期胚胎内多潜能细胞生物学和分化的机制，并为哺乳动物的基因操作和由此产生的商业、医疗和农业应用提供机会。此外，ES细胞的适当增殖和分化能够潜在地用于产生适合于移植的细胞的无限源，用于治疗由细胞损伤或功能障碍导致的疾病。也可以使用其他多能细胞和细胞系，包括早期原始外胚层样细胞(EPL)，体内或体外衍生的ICM/上胚层，体内或体外衍生的原始外胚层，原始生殖细胞(EG细胞)，畸胎癌细胞(EC细胞)以及通过去分化或核移植衍生的多能细胞。因此，需要用于分离真正的胰腺祖细胞的方法。专利技术概述本专利技术提供了用于分离表达PDX1和NKX6.1的真正的胰腺祖细胞的方法。本专利技术的方法基于使用对表达PDX1和/或NKX6.1的细胞特异性的标志物或使用特异于不表达PDX1的细胞的标志物。还提供了通过这样的方法能够获得的细胞群体，以及它们用于治疗代谢紊乱的用途。附图说明图1.eGFP靶向进入人PDX1基因座。A)将编码绿色荧光蛋白(eGFP)的基因插入到hPS细胞系HUES-4中的PDX1基因的5'非翻译区(UTR)中。BD引物扩增WT等位基因，AC引物扩增所有转基因克隆，AD引物扩增所靶向的等位基因(3'HA)。B)针对4个个体克隆(泳道1和4：基因靶向阳性克隆；泳道2)，使用Neo/F和Ex3/R引物显示4个靶向事件的代表性PCR筛选(片段大小5.1kb)。使用整合到PDX1基因座中的包含报道子盒的PDX1eGFPBAC作为阳性对照(BAC)。C)显示在3种不同的hPS细胞系中获得的相对靶向效率的表格。D)显示在第13天所靶向的PDX1-eGFPhES细胞系的荧光和相应的相差图像。比例尺＝100μm。E)在第16天PDX1-GFP靶向细胞系的免疫荧光图像，其显示内源性PDX1表达(红色)与GFP(绿色)的共定位。比例尺＝50μm。F)第17天的PDX1-eGFP+细胞群体的免疫荧光分析。显著数目的GFP+/PDX1+细胞共表达NKX6-1和SOX9。大部分PDX1+细胞也表达ECAD和HES1(数据未显示)。比例尺＝50μm。图2.体外分化的PDX1-eGFPhPSC的分析。A)根据两种不同分化操作方案分化hPSC，以获得共表达PDX1和NKX6-1的胰腺祖细胞(操作方案A(PE))或表达PDX1但缺少NKX6-1的后部前肠细胞(操作方案B(PFG))。B)示意图描绘称为“操作方案A”的分化操作方案，产生胰腺内胚层(PE)。C)在根据操作方案A处理的hPSC中,在第17天FACS分离eGFP+和eGFP-部分。D)分选的eGFP+和eGFP-细胞的基因表达分析显示,用操作方案A获得的eGFP+细胞中胰腺内胚层标志物(重要的是PDX1和NKX6-1)显著富集。数据显示为平均表达±SEM(n＝5)。这些图表示与在第十七天在对照样品(eGFP-细胞)中检测到的相比的倍数增加。对照样品任意设定为数值1。E)示意图描绘称为“操作方案B”的分化操作方案，产生后部前肠细胞。F)根据操作方案B分化的eGFP+和eGFP-细胞(从第17天开始)的FACS分离。G)分选的eGFP+和eGFP-细胞的基因表达分析显示，虽然后部前肠标志物如PDX1、ECAD、HNF6和SOX9在eGFP+细胞中被富集，但在操作方案B获得的eGFP+细胞中NKX6-1和MNX1均未被显著上调。数据以平均表达±SEM表示(n＝2-4)。这些图表示与在第十七天在对照样品(eGFP-细胞)中检测到的相比的倍数增加。对照样品任意设定为数值1。图3.进行微阵列分析以比较体外衍生的PDX1+/NKX6-1+胰腺祖细胞(PPC)与PDX1+/NKX6-1-细胞(PFG)的基因表达谱。A)在胰腺祖细胞(PDX1+/NKX6-1+)、后部前肠细胞(PDX1+/NKX6-1-)和GFP-细胞中差异表达的基因的分级聚类。B)Venn图显示在第17天PPC相比于GFP-，PPC相比于PFG，PFG相比于GFP-细胞中上调的基因的分布。C)在A中所描绘的3-比较分析中差异表达的基因的分级聚类(显示平均表达水平)。条形图表示相关基因的子簇；总共创建了九个不同的子簇。子簇3a显示GFP-细胞群体中富集的基因，包括新的细胞表面标志物CD49d(ITGA4)，而子簇5显示胰腺祖细胞(GFP+细胞部分)中富集的基因，还包括新的细胞表面标志物GP2。子簇6表示在PDX1+细胞中富集的基因而不论NKX6-1表达如何(F2GFP+和GFP+细胞)，如CDH1(ECAD)、EPCAM、F3(CD142)和新的细胞表面标志物FOLR1。D)基因本体论(GO)分析显示PDX1+/NKX6-1+胰腺祖细胞中基因的富集。显示代表性的GO类别，并将其针对-log(p值)进行作图。图4.在hPSC衍生的PDX1+胰腺内胚层中表达的新的细胞表面标志物。A)热图显示GFP+和GFP-部分中定位于质膜中或细胞外区域中的基因的富集。箭头指示不同细胞群体中富集的选定细胞表面标志物。B)对在MEF(d17)上培养的分化的hPSC进行的选定细胞表面标志物GP2和CD49d(ITGA4)的流式细胞术分析证实，GP2在GFP+细胞中高表达，而CD49d在GFP-细胞中富集。更具体地，在第17天大部分GFP-细胞(70-72％)表达CD49d，而64-76％的GFP+细胞共表达GP2。重要的是，只有低比例的GFP-细胞(3-7％)表达GP2，基本上没有GFP+细胞(1-2％)表达CD49d。C)分选的细胞群体的基因表达分析显示，胰腺内胚层标志物和新的细胞表面标志物在GP2+/CD49d-分选的细胞群体中高度富集。D)通过流式细胞术分析在无饲养层系统中培养的遗传上未加标签的细胞系HUES-4中GP2和CD49d的表达。E)分选出GP2+CD49d-、CD49d+GP2-和GP2-CD49d-细胞部分，分析基因表达模式。胰腺内胚层标志物如PDX1、SOX9、MNX1和NKX6-1以及新的细胞表面标志物GP2和FOLR1在GP2+CD49d-细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于分离富集了真正的胰腺祖细胞的群体的方法，所述方法包括以下步骤：i)提供包含至少一个真正的胰腺祖细胞的细胞群体，其中所述真正的胰腺祖细胞表达PDX1和NKX6‑1；和ii)将所述细胞群体暴露于：a)第一配体，其与PDX1‑细胞特异性的第一标志物结合，并从所述细胞群体选择不结合所述第一配体的细胞，由此使所述细胞群体富集PDX1+细胞；和/或b)第二配体，其与PDX1+细胞特异性的第二标志物结合，并从不与所述第二配体结合的细胞选择与所述第二配体结合的细胞，由此使所述细胞群体富集PDX1+细胞；和/或c)第三配体，其与PDX1+NKX6‑1+细胞特异性的第三标志物结合，并从不与所述第三配体结合的细胞选择与所述第三配体结合的细胞，由此使所述细胞群体富集PDX1+NKX6‑1+细胞；由此获得富集了真正的胰腺祖细胞的细胞群体。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.04.24 EP 15164999.31.用于分离富集了真正的胰腺祖细胞的群体的方法，所述方法包括以下步骤：i)提供包含至少一个真正的胰腺祖细胞的细胞群体，其中所述真正的胰腺祖细胞表达PDX1和NKX6-1；和ii)将所述细胞群体暴露于：a)第一配体，其与PDX1-细胞特异性的第一标志物结合，并从所述细胞群体选择不结合所述第一配体的细胞，由此使所述细胞群体富集PDX1+细胞；和/或b)第二配体，其与PDX1+细胞特异性的第二标志物结合，并从不与所述第二配体结合的细胞选择与所述第二配体结合的细胞，由此使所述细胞群体富集PDX1+细胞；和/或c)第三配体，其与PDX1+NKX6-1+细胞特异性的第三标志物结合，并从不与所述第三配体结合的细胞选择与所述第三配体结合的细胞，由此使所述细胞群体富集PDX1+NKX6-1+细胞；由此获得富集了真正的胰腺祖细胞的细胞群体。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一、第二和第三配体中的至少一个是抗体或其片段。3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗体是单克隆或多克隆抗体。4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一、第二和第三配体中的至少一个与所述真正的胰腺祖细胞的细胞表面标志物结合。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一、第二和第三配体中的至少一个与标记物缀合。6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过流式细胞术检测所述第一、第二和第三标志物中的至少一个的表达。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过流式细胞术去除或选择所述细胞。8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一配体是针对CD49d的抗体或其片段。9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二配体是针对选自由FOLR1、CDH1/ECAD、F3/CD142、PDX1、FOXA2、EPCAM、HES1和GATA4组成的组的靶的抗体或其片段。10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二配体是针对FOLR1的抗体或其片段。11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第三配体是针对选自由GP2、SCN9A、MPZ、NAALADL2、KCNIP1、CALB1、SOX9、NKX6-2和NKX6-1组成的组的靶的抗体或其片段。12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第三配体是针对GP2的抗体或其片段。13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一配体是针对CD49d的抗体或其片段，并且所述第三配体是针对GP2的抗体。14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一配体是针对CD49d的抗体或其片段，所述第二配体是针对FOLR1的抗体或其片段，并且所述第三配体是针对GP2的抗体或其片段。15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法包括以下步骤：i)提供包含至少一个真正的胰腺祖细胞的细胞群体，其中所述真正的胰腺祖细胞表达PDX1和NKX6-1；和ii)将所述细胞群体暴露于与PDX1+NKX6-1+细胞特异性的第三标志物结合的第三配体，并从不与所述第三配体结合的细胞选择与所述第三配体结合的细胞，由此使所述细胞群体富集PDX1+NKX6-1+细胞，其中所述第三个标志物是GP2；由此获得富集了真正的胰腺祖细胞的细胞群体。16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法包括以下步骤：i)提供包含至少一个真正的胰腺祖细胞的细胞群体，其中所述真正的胰腺祖细胞表达PDX1和NKX6-1；和ii)将所述细胞群体暴露于：a)第二配体，其与PDX1+细胞特异性的第二标志物结合，并从不与所述第二配体结合的细胞选择与所述第二配体结合的细胞，由此使所述细胞群体富集PDX1+细胞，其中所述第二标志物是FOLR1；和b)第三配体，其与PDX1+NKX6-1+细胞特异性的第三标志物结合，并从不与所述第三配体结合的细胞选择与所述第三配体结合的细胞，由此使所述细胞群体富集PDX1+NKX6-1+细胞，其中所述第三标志物是GP2；由此获得富集了真正的胰腺祖细胞的细胞群体。17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述真正的胰腺祖细胞衍生自能够分化的细胞，如人多能干细胞。18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述能够分化的细胞选自由人iPS细胞(hIPSC)、人ES细胞(hESC)和初始人干细胞(NhSC)组成的组。19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述能够分化的细胞衍生自从个体分离的细胞。20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中富集胰腺祖细胞的细胞群体中的至少一个细胞具有进一步分化的能力。21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述富集胰腺祖细胞的细胞群体中的至少一个细胞具有进一步分化为产生胰腺激素的细胞的能力。22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述产生胰腺激素的细胞中的至少一个细胞是产生胰岛素的细胞和/或对葡萄糖有反应。23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述富集胰腺祖细胞的细胞群体的至少一个细胞能够产生产生胰岛素的胰岛细胞。24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤i)中提供的细胞群体中，CDKN1a和/或CDKN2a是失活的。25.根据权利要求24所述的方法，其中CDKN1a和/或CDKN2a是通过敲低、缺失，沉默或阻遏而失活的。26.根据权利要求24至25中任一项所述的方法，其中起始细胞群体是表达PDX1的胰腺祖细胞群体。27.根据权利要求24至26中任一项所述的方法，其中与当CDKN1a和/或CDKN2a不是失活的时候进入...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·阿米里，H·塞姆，
申请(专利权)人：哥本哈根大学，
类型：发明
国别省市：丹麦,DK