含氧二萜化合物的制备制造技术

本发明专利技术公开了一种通过插入编码特定细胞色素P450酶的基因、并在所选宿主细胞中表达所述基因以合成所述化合物来制备含氧二萜化合物(如雷酚内酯、雷公藤内酯酮和雷公藤甲素)的方法。进一步公开了适用于该合成的特定细胞色素P450酶。素P450酶。素P450酶。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】含氧二萜化合物的制备
[0001]序列列表参考
[0002]本申请包含计算机可读形式的序列列表，其通过引用并入。


[0003]本专利技术涉及在重组细胞如酵母细胞中生产含氧二萜化合物。含氧二萜化合物可用作合成有用生物活性化合物的中间或最终化合物，以用于例如药物治疗疾病(例如癌症)。本专利技术还涉及特别适合于生产这种化合物的基因、酶和细胞，例如酵母细胞。

技术介绍

[0004]萜烯是一组由基本的5碳结构异戊二烯(2
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甲基
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1,3
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丁二烯)生成的多种化合物。二萜是具有20个碳结构的化合物，由一种酶二萜合酶的作用产生，该酶将化合物双(牻牛儿基)二磷酸盐(GGPP)转化为二萜结构，这通过进一步修饰可以形成广泛的Diterpene或二萜化合物。
[0005]Diterpene、二萜及其衍生物被广泛用作药物、化妆品、营养品、香料、香料和杀虫剂。在天然或工程细胞中增加这些化合物的产生的方法在本领域中是丰富的。
[0006]已知雷公藤这种中药植物能产生几种具有潜在药理性能的倍半萜、二萜和三萜，包括二萜化合物雷公藤内酯酮和雷公藤甲素。雷公藤甲素，一种含氧二萜化合物，及其衍生物已被确定为潜在的有价值的药理化合物，并正在作为免疫抑制剂和治疗癌症进行研究。雷公藤甲素可进一步用于治疗COVID
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19。雷公藤内酯酮可能用作男性避孕药。
[0007]使用工程微生物从可再生原料中生产有价值的分子是传统生产方式的理想选择。然而，实现经济上可行的产量、效价和生产率是工业化的主要障碍。
[0008]N L Hansen等人(2017)在The PlantJournal 2017,89,429
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441中描述一种二萜合酶，能够将GGPP转化为dipterpene，即松香烷型二萜烯，这是雷公藤甲素的前体。P Su等人(2018)在The plantJournal 2018,50
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65:和J Guo等人(2018)在PNAS 2013,110,12108
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12113中证实了这一发现。
[0009]将松香烷型二萜烯转化为其他二萜化合物(如雷公藤甲素)的完整途径尚未阐明。
[0010]细胞色素P450酶(CYP)参与terpenoid的生物合成，对于许多细胞色素P450酶来说，对于它们作用的底物、它们产生的化合物或它们在特定化合物生物合成中的作用一无所知。
[0011]US 20190270971A1公开了用于提高功能性表达p450酶的微生物宿主细胞的生产率的方法。该文件描述了如何修饰P450基因以提高微生物(如酵母)的性能，并提到与细胞色素P450还原酶的共表达有助于提高产量。提到雷公藤甲素可能是P450化学的主题，但该文件没有提供雷公藤甲素与任何特定P450酶或细胞色素之间的任何联系。
[0012]CN 108395997A描述了GGPP产量增加的酵母。用不同的二萜合酶和P450酶转化酵母以合成二萜化合物。该专利背后的科学家团队还支持更多的专利和专利申请，公开了使用合适的terpene合成酶和P450酶合成不同的二萜和三萜化合物，例如CN 108866029
(friedelin)、CN 107058419(Kauren型)和WO 2020029564(Fridelin和amyrins)。
[0013]CN 110747178A将P450基因TwCYP728B70描述为编码在雷公藤甲素合成中具有作用的细胞色素P450酶。

技术实现思路

[0014]本专利技术人解决了提供一种制备含氧二萜化合物如雷酚内酯、雷公藤内酯酮和雷公藤甲素的改进方法的问题。
[0015]在第一方面，本专利技术涉及一种制备含氧二萜化合物的方法，该方法包括以下步骤：
[0016]a.提供能够产生松香烷型二萜烯和/或脱氢松香二烯的宿主细胞；
[0017]b.用编码具有细胞色素P450活性的酶的第一基因转化宿主细胞；
[0018]c.在导致转化基因表达的条件下生长转化细胞；由此形成含氧二萜化合物；
[0019]其中：
[0020]编码具有细胞色素P450活性的酶的第一基因编码多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:1(TwCYP82D274v1)、SEQ ID NO:2(TwCYP82D274v2)、SEQ ID NO:74(TwCYP82D274v3)或SEQ ID NO:75(TwCYP82D274v4)具有至少80％序列同一性、优选至少85％序列同一性、优选至少90％序列同一性，优选至少95％序列同一性、更优选至少98％序列同一性的氨基酸序列，或其成熟多肽。
[0021]在第二方面，本专利技术涉及制备含氧二萜化合物的方法，并包括用编码具有细胞色素P450活性的酶的第一基因和进一步用编码具有细胞色素P450活性的第二酶的第二基因以及编码具有细胞色素P450活性的第三酶的第三基因转化宿主细胞，
[0022]其中：
[0023]编码具有细胞色素P450活性的酶的第二基因编码多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:3(TwCYP71BE85)具有至少80％序列同一性、优选至少85％序列同一性、优选至少90％序列同一性，优选至少95％序列同一性、更优选至少98％序列同一性的氨基酸序列，或其成熟多肽；和
[0024]编码具有细胞色素P450活性的酶的第三基因编码多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:4(TwCYP71BE85)具有至少80％序列同一性、优选至少85％序列同一性、优选至少90％序列同一性，优选至少95％序列同一性、更优选至少98％序列同一性的氨基酸序列，或其成熟多肽。
[0025]在第三方面，本专利技术涉及制备含氧二萜化合物的方法，其中所述方法包括用编码具有细胞色素P450活性的酶的第一、第二和第三基因转化宿主细胞，并且进一步用编码具有细胞色素P450活性的第四酶的第四基因转化宿主；
[0026]其中：
[0027]编码具有细胞色素P450活性的酶的第四基因编码多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:5(TwCYP82D213v1)或SEQ ID NO:76(TwCYP82D213v2)具有至少80％序列同一性、优选至少85％序列同一性、优选至少90％序列同一性，优选至少95％序列同一性、更优选至少98％序列同一性的氨基酸序列，或其成熟多肽。
[0028]根据本专利技术，可以提供有用的含氧二萜化合物雷酚内酯、雷公藤内酯酮或雷公藤甲素。
[0029]本专利技术还涉及用于本专利技术方法的多肽、多核苷酸、质粒和表达构建体以及重组宿主细胞。
附图说明
[0030]图1显示了表达miltiredene生物合成基因和选定的T.wilfordii CYP的N.benthamiana叶提取物的LCMS谱。
[0031]TwCYP与CfDXS、CfGGPPS、CfTPS1和CfTPS3共本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种能够产生含氧二萜化合物的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞：i.能够产生松香烷型二萜烯和/或脱氢松香二烯；和ii.包含编码具有细胞色素P450活性的第一酶的第一异源核酸，其中所述具有细胞色素P450活性的第一酶是SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO：74或SEQ ID NO:75中所述的细胞色素P450酶TwCYP82D274，或其具有至少80％序列同一性、优选至少85％序列同一性、优选至少90％序列同一性、优选至少95％序列同一性、更优选至少98％序列同一性的功能同系物、或其成熟多肽，由此宿主细胞能够将松香烷型二萜烯和/或脱氢松香二烯转化为14
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羟基脱氢松香二烯。2.根据权利要求1所述的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞进一步包含编码具有细胞色素P450活性的第二酶的第二异源核酸，其中所述具有细胞色素P450活性的第二酶是SEQ ID NO:4中所述的细胞色素P450酶TwCYP71BE86，或其具有至少80％序列同一性、优选至少85％序列同一性、优选至少90％序列同一性、优选至少95％序列同一性、更优选至少98％序列同一性的功能同系物、或其成熟多肽。3.根据权利要求2所述的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞包含并表达所述第一异源核酸和所述第二异源核酸，由此所述细胞能够产生14
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羟基脱氢松香二烯、3,14
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二羟基脱氢松香二烯、3,14
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dihydroxyabeodiene和14
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羟基
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18
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醛
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abeodiene。4.根据前述权利要求中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞还包含编码具有细胞色素P450活性的第三酶的第三异源核酸，其中所述具有细胞色素P450活性的第三酶是SEQ ID NO:3中所述的细胞色素P450酶TwCYP71BE85，或其具有至少80％序列同一性、优选至少85％序列同一性、优选至少90％序列同一性、优选至少95％序列同一性、更优选至少98％序列同一性的功能同系物、或其成熟多肽。5.根据权利要求4所述的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞包含并表达所述第一异源核酸和所述第三异源核酸，由此所述细胞能够产生14
‑
羟基脱氢松香二烯。6.根据权利要求4所述的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞包含并表达所述第一异源核酸、所述第二异源核酸和所述第三异源核酸，由此所述细胞能够产生14
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羟基脱氢松香二烯、3,14
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二羟基脱氢松香二烯、3,14
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dihydroxyabeodiene、14
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羟基
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18
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醛
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abeodiene和雷酚内酯。7.根据前述权利要求中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞还包含编码具有细胞色素P450活性的第四酶的第四异源核酸，其中所述具有细胞色素P450活性的第四酶是SEQ ID NO:5中所述的细胞色素P450酶TwCYP82D213，或其具有至少80％序列同一性、优选至少85％序列同一性、优选至少90％序列同一性、优选至少95％序列同一性、更优选至少98％序列同一性的功能同系物、或其成熟多肽。8.根据权利要求7所述的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞包含并表达所述第一异源核酸、所述第二异源核酸和所述第三异源核酸以及所述第四异源核酸，由此所述细胞能够产生14
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羟基脱氢松香二烯、3,14
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二羟基脱氢松香二烯、3,14
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dihydroxyabeodiene、14
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羟基
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18
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醛
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abeodiene、雷酚内酯和雷公藤内酯酮。9.根据前述权利要求中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含编码具有细胞色素P450活性的第五酶的第五异源核酸，其中所述具有细胞色素P450活性的第五酶是SEQ ID NO:6中所述的细胞色素P450酶TwCYP82D217，或其具有至少80％序列同一性、优
选至少85％序列同一性、优选至少90％序列同一性、优选至少95％序列同一性、更优选至少98％序列同一性的功能同系物、或其成熟多肽。10.根据前述权利要求中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含编码具有细胞色素P450活性的第六酶的第六异源核酸，其中所述具有细胞色素P450活性的第六酶是SEQ ID NO:7中所述的细胞色素P450酶TwCYP82D275，或其具有至少80％序列同一性、优选至少85％序列同一性、优选至少90％序列同一性、优选至少95％序列同一性、更优选至少98％序列同一性的功能同系物、或其成熟多肽。11.根据前述权利要求中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含编码具有细胞色素B5活性的酶的第七异源核酸，其中所述具有细胞色素B5活性的酶是SEQ ID NO:8中所述的细胞色素B5 TwB5#1，或其具有至少80％序列同一性、优选至少85％序列同一性、优选至少90％序列同一性、优选至少95％序列同一性、更优选至少98％序列同一性的功能同系物、或其成熟多肽。12.根据前述权利要求中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞表达以下一种或多种：i.双(牻牛儿基)二磷酸合酶；ii.能够将双(牻牛儿基)二磷酸盐(GGPP)转化为松...

【专利技术属性】
技术研发人员：J，
申请(专利权)人：哥本哈根大学，
类型：发明
国别省市：