本发明专利技术涉及多能细胞在体外分化为胰腺祖细胞，通过i)在定形内胚层(DE)培养基中培养多能细胞以生成定形内胚层细胞的细胞群，该培养基包括TGFβ配体、成纤维细胞生长因子(FGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、PI3K抑制剂和可选的GSK3β抑制剂，ii)在第一胰腺培养基中培养定形内胚层细胞以生成背侧前肠细胞的细胞群，所述第一胰腺培养基含有激活素拮抗剂；FGF；视黄酸；和BMP抑制剂；iii)在第二胰腺培养基中培养所述背侧前肠细胞，所述第二胰腺培养基含有FGF、视黄酸、BMP抑制剂和hedgehog信号传导抑制剂，以及；iv)在第三胰腺培养基中培养内胚层细胞，所述第三胰腺培养基含有FGF。这样生成的祖细胞可以进一步分化成胰腺内分泌细胞。这些方法可能是有用的，例如，在生成胰腺细胞用于治疗或疾病建模时。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及体外诱导多能哺乳动物细胞中的胰腺分化。
技术介绍
胰腺0细胞的生成代表了再生医学的主要目标。事实上，这些细胞的大量供应将 使基于细胞的糖尿病疗法得以发展，该疗法目前受限于缺乏捐赠器官和在体外扩大胰岛素 分泌细胞的难度。胚胎来源（人类胚胎干细胞或hESC)或由重编程体细胞（人类诱导 多能干细胞或hIPSC) 产生的人类多能干细胞（hPSC)提供了绕过这些限制的前景。事 实上，这些细胞能够在体外无限增殖，同时保持分化成各种类型细胞的能力，包括胰腺祖细 胞。然而，在确定成分培养条件下允许生成这些细胞的同质群体的健全的方法尚未确 立。实际上，现有的方法包含一些未限定的动物产品，如饲养物、胎牛血清（FBS)和基质胶。 此外，它们只允许细胞的异质群体的产生，因而增加了移植后的畸胎瘤形成的风 险。它们也似乎仅在有限的几个hPSC细胞系上起到有效作用，这妨碍了它们在 很多实验室中的应用。 大多数目前用于hPSC直接分化的培养系统模仿正常发育，因为这种方法可以促 进全功能的细胞类型的生成。因此，来自于小鼠或其它脊椎动物模型研宄的知识已被用来 提供人类hPSC向特定种系发展的策略的信息。 胰腺和肝脏约在胚胎第8. 5天到9. 5天，在诱导信号的影响下从发育中的原始前 肠的相邻区域出现，这些诱导信号由附近的中胚层分泌。这些信号有可能指挥对胰腺特 化必要的转录因子的表达，如标志着胰芽形成前的背侧前肠的HXLB9和标志着腹 侧和背侧胰芽出现的前肠区域的H)X1 。 新形成的胰腺祖很快表达其它的标志物，包括PTF1A、NKX6. 1和S0X9,这些祖细胞 产生了胰腺的内分泌（胰岛）和外分泌（腺泡和导管细胞）细胞。类似的机制控制着肝的 特化，虽然它们涉及不同的转录因子组，如HEX、GATA6、PR0X1和HNF4 a 和不同的信号 传导通路，如BMP和的FGF。虽有这样广泛的知识，但是用以协调胰腺或肝祖细胞转录 网的细胞外信号传导通路的分子机制，尤其是在人体内的机制，仍有待阐明，而且hPSC可 能具有独特的优势来完成这一主要任务。
技术实现思路
本专利技术涉及一种用于多能细胞体外高效分化成胰腺祖细胞和胰腺内分泌细胞的 方法。本方法对于例如在基于细胞的疗法或疾病建模中产生胰腺细胞可能是有用的。 本专利技术的一个方面提供了一种产生胰腺祖细胞的细胞群的方法，包括： i)提供多能细胞的细胞群； ii)在定形内胚层（DE)诱导培养基中培养该细胞群，以产生定形内胚层细胞的细 胞群，其中，所述DE诱导培养基含有TGF0配体、成纤维细胞生长因子（FGF)、骨形态发生蛋 白（BMP)、PI3K抑制剂和可选的GSK3 0抑制剂； iii)在第一胰诱导培养基中培养定形内胚层细胞的细胞群，以产生背侧前肠细胞 的细胞群，该第一胰诱导培养基含有激活素拮抗剂；FGF;视黄酸；和BMP抑制剂； iv)在第二胰诱导培养基中培养背侧前肠细胞，该第二胰诱导培养基含有FGF、视 黄酸、BMP抑制剂和hedgehog信号传导抑制剂； v)在第三胰诱导培养基中培养内胚层细胞，该第三胰诱导培养基含有FGF ; 从而产生胰腺祖细胞的细胞群。 所述胰腺祖细胞可进一步分化成胰腺内分泌细胞。例如，一种方法可以进一步包 括； (vi)在第一内分泌诱导培养基和第二内分泌诱导培养基中培养胰腺祖细胞的细 胞群，以产生胰腺内分泌细胞的细胞群。 多能细胞是一种显示出未分化的表型的细胞，具有潜在的多能性，即它能够分化 成三个胚层（内胚层、中胚层和内胚层）中的任何一层的任何胎儿或成人细胞类型。多能 细胞不同于全能细胞，其不能产生胚外细胞系。多能细胞可以表达下列多能相关标志物中 的一种或多种：0ct4、Sox2、碱性磷酸酶、P0U5fl、SSEA-3、Nanog、SSEA-4、Tra-1-60、KLF-4 和c-myc，优选为P0U5f 1、NAN0G和S0X2。人类多能细胞可能会缺乏与特定分化命运相关的 标志物，如 Bra、Soxl7、FoxA2、a FP、Soxl、NCAM、GATA6、GATA4、Handl 和 CDX2〇 多能细胞可以是哺乳动物细胞，优选为人类细胞。 多能细胞群可以是克隆的，即从单个共同的祖先细胞传代而来的遗传上相同的细 胞。 适用于本方法的多能细胞群可以基本上不含一种或多种其它细胞类型。多能细 胞可以是，例如，使用本领域技术人员所公知的任何技术由其他类型的细胞中分离而来，上 述本领域技术人员所公知的任何技术包括那些基于依靠抗体和磁珠或荧光激活细胞分选 (MACS或FACS)的细胞外表位识别的技术，这些技术包括使用抗在干细胞上发现的分子的 胞外区域如SSEA4的抗体。多能细胞可以包括胚胎干细胞（ESC)、胎儿和成人体干细胞和iPS细胞。 合适的胚胎干细胞可以用常规技术来获得。例如，ESC细胞可以由培养的ESC 细胞系中获得，例如，从hESC细胞系中获得。许多培养的hESC细胞系是可从储存库（例 如，美国国立卫生研宄院的人类胚胎干细胞登记处）公开获得的，如CHB-1至CHB-12、 RUES1 至 RUES3、HUES1 至 HUES28、HUES45、HUES48、HUES49、HUES53、HUES62 至 HUES66、 WA01 (HI)、WA07 (H7)、WA09 (H9)、WA13 (H13)、WA14 (H14)、NYUES1 至 NYUES7、MFS5 和 UCLA1 至UCLA3。合适的人类胚胎干细胞系的其它实例在这些文献中描述（Thomson JA等人.科 学 282:1145-1147 (1998) ;Reubinoff 等人.自然生物技术 18:399-404(2000) ;Cowan，C. A.等人?英格兰医学杂志.350,1353-1356(2004)，Gage, F.H.等人?神经科学年度评 论.18159-192(1995);以及 Gotlieb (2002)神经科学年度评论 25381-407) ;Carpenter 等 人?干细胞.5(1) :79-88(2003)。潜在临床级hESC在Klimanskaya，I.等人?柳叶刀365， 1636-1641(2005)以及 Ludwig, T.E?等人.自然生物技术.24,185-187 (2006)中有描述。 合适的hESC可以在不破坏人类胚胎的情况下获得。 在其他【具体实施方式】中，所述多能细胞不是hESC，并且可以是，例如，胎儿或成人 体干细胞或iPS细胞，优选为人类iPS细胞。 iPS细胞是由非多能、完全分化的始祖细胞衍生而来的多能细胞。合适的始祖细胞 包括成人成纤维细胞和外周血细胞。始祖细胞通常通过引入多能性基因或蛋白，如0ct4、 Sox2和Soxl到细胞内进行重编程。上述基因或蛋白可以通过任何合适的技术，包括质粒 或更优选为病毒转染或直接蛋白输送，被引入分化的细胞内。其它基因，例如Kif基因，如 Kif-1、-2、-4 和-5 ;Myc 基因，如 C-myc、L-myc 和 N-myc ;nanog ;以及 Lin28 也可导入细胞 以增加诱导效率。引入多能性基因或蛋白后，可以培养所述始祖细胞。表达多能性标志物 的细胞可被分离和/或纯化，以产生iPS本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种产生胰腺祖细胞的细胞群的方法，包括：i)提供多能细胞的细胞群；ii)在定形内胚层(DE)诱导培养基中培养所述细胞群，以产生定形内胚层细胞的细胞群，其中，所述定形内胚层(DE)诱导培养基包括TGFβ配体、成纤维细胞生长因子(FGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、PI3K抑制剂和可选的GSK3β抑制剂；iii)在第一胰诱导培养基中培养所述定形内胚层细胞的细胞群，以产生背侧前肠细胞的细胞群，所述第一胰诱导培养基包括激活素拮抗剂；FGF；视黄酸；和BMP抑制剂；iv)在第二胰诱导培养基中培养所述背侧前肠细胞，所述第二胰诱导培养基包括FGF、视黄酸、BMP抑制剂和hedgehog信号传导抑制剂；v)在第三胰诱导培养基中培养所述内胚层细胞，所述第三胰诱导培养基包括FGF；从而产生胰腺祖细胞的细胞群。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：鲁多维奇·瓦利耶，卓欣樺，
申请(专利权)人：剑桥企业有限公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB
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