RNA反式剪接分子制造技术

本发明专利技术涉及靶向人内源性逆转录病毒(HERV)前体mRNA的RNA反式剪接分子(RTM)。所述RTM包含(i)对HERV前体mRNA具有特异性的结合区，(ii)反式剪接结构域，和(iii)用于自杀蛋白的编码序列。RTM的结合区与细胞中的HERV前体mRNA结合，使得编码序列通过反式剪接结构域与HERV前体mRNA进行反式剪接，从而产生导致自杀蛋白在所述细胞中表达的嵌合mRNA。本发明专利技术的RTM可用于选择性地杀伤表达HERV基因的细胞，例如癌细胞。提供了RTM、编码核酸、治疗方法以及相关方法和用途。及相关方法和用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】RNA反式剪接分子


[0001]本专利技术涉及RNA反式剪接分子(RTM)，特别是介导自杀基因反式剪接的RTM，以及它们在癌症治疗中的用途。

技术介绍

[0002]RNA反式剪接是剪接体介导的过程，其中两个不同的RNA分子被剪接在一起从而在细胞核中生成嵌合mRNA分子。核输出后，嵌合mRNA分子在细胞质中被翻译以产生嵌合蛋白。
[0003]RNA反式剪接已被用于将有缺陷的RNA转录物与反式递送的经校正mRNA分子交换(Hong等人(2020)Br Med Bull.2020Dec15；136(1):4
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20)。
[0004]RNA反式剪接也已被用于作为一种潜在的癌症疗法递送两步单纯疱疹病毒胸苷激酶
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更昔洛韦(HSV
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tk/GCV)细胞死亡系统(Kim等人(2016).Theranostics 6 357
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368；Kwon等人,(2005).Mol.Ther 12,5824
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834；Jung等人(2006).Biochem.Biophys.Res.Commun,349,556
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563；Song等人(2009).Cancer Gene Ther 16,113
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125；Song等人(2006).FEBS Letters 580,5033
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5043；Won等人(2007).J.Biotechnol.129,614
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619；Won等人(2012).J.Biotechnol.158,44
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49)。单纯疱疹病毒胸苷激酶通过磷酸化催化前药更昔洛韦转化为活性化合物，导致DNA复制和细胞死亡期间的链终止(Duarte,S等人(2012).Cancer Letters 324,160
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170)。
[0005]RNA反式剪接也已被用于靶向HIV(Ingemarsdotter,C.K.et al(2017)Mol.Ther.Nucleic acids,7,140
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154)和癌症特异性RNA(Poddar等人(2018).Mol.Ther.Nucleic Acids,11,41
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56；WO2017171654A1、US2015079678A1、WO2014068063A1)。

技术实现思路

[0006]本专利技术人开发了一种靶向人内源性逆转录病毒(HERV)前体mRNA的RNA反式剪接分子(RTM)。该RTM可用于选择性杀伤表达HERV基因的细胞，例如癌细胞。
[0007]本专利技术的第一方面提供了RNA反式剪接分子(RTM)，其包含：
[0008](i)对HERV前体mRNA具有特异性的结合区，
[0009](ii)反式剪接的剪接结构域
[0010](iii)用于自杀蛋白的编码序列。
[0011]RTM的结合区与细胞中的HERV前体mRNA结合，使得编码序列通过反式剪接结构域与HERV前体mRNA进行反式剪接，从而产生导致自杀蛋白在所述细胞中表达的嵌合mRNA。
[0012]优选的RTM可包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列、SEQ ID NO:15的氨基酸序列或这些中任一者的变体。
[0013]本专利技术的第二方面提供了编码第一方面的RTM的核酸。优选的核酸可包含SEQ ID NO:14的核苷酸序列、SEQ ID NO:16的核苷酸序列，或这些中任一者的变体。
[0014]本专利技术的第三方面提供了包含第二方面的核酸的表达载体。
[0015]本专利技术的第四方面提供了包含第一方面的RTM、第二方面的核酸或第三方面的表达载体的病毒颗粒。
[0016]本专利技术的第五方面提供了包含第一方面的RTM、第二方面的核酸和/或第三方面的表达载体的经分离的细胞。
[0017]本专利技术的第六方面提供了药物组合物，其包含第一方面的RTM、第二方面的核酸、第三方面的表达载体和/或第四方面的病毒颗粒。
[0018]本专利技术的第七方面提供了治疗癌症的方法，其包括：
[0019]向有需要的个体施用第一方面的RTM、第二方面的核酸、第三方面的表达载体、第四方面的病毒颗粒和/或第六方面的药物制备物。
[0020]第七方面的方法还可包括向个体施用由自杀蛋白激活的细胞毒性化合物。例如，可以将无活性的前体形式(pro
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form)施用于个体，并且自杀蛋白可以在表达自杀蛋白的细胞中将无活性的前体形式转化为细胞毒性化合物的活性形式。可在第一治疗中将细胞毒性化合物施用于个体，并且在第一治疗之后施用一种或多种进一步的治疗。
[0021]本专利技术的第八方面提供了第一方面的RTM、第二方面的核酸、第三方面的表达载体、第四方面的病毒颗粒和/或第六方面的药物制备物，其用于治疗癌症的方法，例如第七方面的方法；以及第一方面的RTM、第二方面的核酸、第三方面的表达载体、第四方面的病毒颗粒和/或第六方面的药物制备物在制造用于治疗癌症的方法(例如第七方面的方法)的药物中的用途。
[0022]RTM、核酸、表达载体、病毒颗粒和/或药物制备物可以与由自杀蛋白激活的细胞毒性化合物组合提供。
[0023]本专利技术的第九方面涉及预防接受细胞疗法的个体的癌症发生或复发的方法，该方法包括向有需要的个体施用根据第五方面的细胞群体。
[0024]该方法还可以包括向个体施用由自杀蛋白激活的细胞毒性化合物的无活性前体形式，使得细胞毒性化合物在个体中已变成癌性或正在变成癌性的群体的细胞中被激活。
[0025]本专利技术的第十方面涉及体外杀伤细胞的方法，其包括：
[0026]将细胞与第一方面的RTM、第二方面的核酸、第三方面的表达载体、第四方面的病毒颗粒和/或第六方面的药物制备物接触，使得该细胞表达自杀蛋白；以及，
[0027]将该细胞与由自杀蛋白激活的细胞毒性化合物接触，使得自杀蛋白激活细胞毒性化合物并杀伤该细胞。
[0028]本专利技术的第十一方面涉及清除群体中HERV基因表达细胞的方法，该方法包括：
[0029]将细胞群体与第一方面的RTM、第二方面的核酸、第三方面的表达载体、第四方面的病毒颗粒和/或第六方面的药物制备物接触，使得HERV基因表达细胞在该细胞群体中表达自杀蛋白；以及，
[0030]将该群体与由自杀蛋白激活的细胞毒性化合物接触，使得自杀蛋白激活该群体中HERV基因表达细胞中的细胞毒性化合物，从而清除该群体中HERV基因表达细胞。
[0031]在第一至第十一方面的优选实施方案中，该自杀蛋白可以是HSV胸苷激酶并且该细胞毒性化合物可以是更昔洛韦。
[0032]下面更详细地描述本专利技术的其他方面和实施方案。
附图说明
[0033]图1示出了具有所描绘的gag、pro、pol和env开放阅读框(ORF)的HERV
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K I类和II类的基因本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种RNA反式剪接分子(RTM)，其包含：(i)对HERV前体mRNA具有特异性的结合区，(ii)反式剪接结构域，和(iii)用于自杀蛋白的编码序列。2.根据权利要求1所述的RTM，其中所述结合区与细胞中的HERV前体mRNA特异性地结合，使得所述编码序列与所述HERV mRNA反式剪接，导致所述自杀蛋白在所述细胞中表达。3.根据权利要求1或权利要求2所述的RTM，其中所述HERV前体mRNA是HERV
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K前体mRNA。4.根据权利要求3所述的RTM，其中所述HERV
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K前体mRNA是HERV
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K Np9或HERV
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K Rec前体mRNA。5.根据权利要求3所述的RTM，其中所述结合区与所述HERV
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K Np9或HERV
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K Rec前体mRNA内SEQ ID NO:2的核苷酸序列特异性地结合。6.根据前述权利要求中任一项所述的RTM，其中所述结合区包含SEQ ID NO:4的核苷酸序列或其变体。7.根据权利要求6所述的RTM，其中所述结合区包含作为SEQ ID NO:4的变体的核苷酸序列，所述核苷酸序列在对应于SEQ ID NO:4的位置4、19、20、32和34的一个或多个位置处具有相对于SEQ ID NO:4的修饰。8.根据权利要求7所述的RTM，其中所述结合区包含作为SEQ ID NO:4的变体的核苷酸序列，所述核苷酸序列在对应于SEQ ID NO:4的位置4的位置处具有C到U取代；在对应于位置19的位置处具有A到U取代；在对应于位置20的位置处具有A到U取代；在对应于位置32的位置处具有A到G取代；以及在对应于位置34的位置处具有A到G取代。9.根据前述权利要求中任一项所述的RTM，其中所述结合区包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列或其变体。10.根据前述权利要求中任一项所述的RTM，其中所述自杀蛋白是单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶。11.根据权利要求10所述的RTM，其中所述HSV胸苷激酶包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或其变体。12.根据权利要求10或11所述的RTM，其中所述HSV胸苷激酶包含作为SEQ ID NO:6的变体的氨基酸序列，所述氨基酸序列在对应于SEQ ID NO:6的位置46和60的位置处，任选地在对应于SEQ ID NO:6的位置1、46和60的位置处，具有相对于SEQ ID NO:6的修饰。13.根据权利要求12所述的RTM，其中所述HSV胸苷激酶包含作为SEQ ID NO:6的变体的氨基酸序列，所述氨基酸序列在对应于SEQ ID NO:6的位置46的位置处具有M到L取代；以及在对应于SEQ ID NO:6的位置60的位置处具有M到I取代，以及任选地在对应于SEQ ID NO:6的位置1的位置处具有M缺失。14.根据权利要求10至13中任一项所述的RTM，其中所述HSV胸苷激酶包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或其变体。15.根据前述权利要求中任一项所述的RTM，其进一步包含位于所述RTM的结合结构域和所述反式剪接结构域之间的间隔区。16.根据权利要求15所述的RTM，其中所述间隔区包含SEQ ID NO:10的序列或其变体。17.根据前述权利要求中任一项所述的RTM，其沿5'至3'方向依次包含所述结合区、所
述反式剪接结构域和所述编码序列。18.根据权利要求17所述的RTM，其中所述反式剪接结构域包含受体位点。19.根据权利要求18所述的RTM，其中所述反式剪接结构域包含SEQ ID NO:12的核苷酸序列或其变体。20.根据权利要求17至19中任一项所述的RTM，其进一步包含编码2A自切割肽的序列，所述序列位于所述RTM的所述反式剪接结构域和所述编码序列之间。21.根据权利要求20所述的RTM，其中所述2A切割位点包含SEQ ID NO:11的序列或其变体。22.根据权利要求17至21中任一项所述的RTM，其中用于所述自杀蛋白的所述编码序列缺少起始密码子。23.根据权利要求17至22中任一项所述的RTM，其包含SEQ ID NO:13的核酸序列；SEQ ID NO:13的变体；SEQ ID NO:15；或SEQ ID NO:15的变体。24.根据权利要求1至16中任一项所述的RTM，其沿5'至3'方向依次包含：所述编码序列、反式剪接结构域和所述结合区。25.根据权利要求23所述的RTM，其中所述反式剪接结构域包含剪接供体位点。26.根据权利要求24或25中任一项所述的RTM，其中用于所述自杀蛋白的所述编码序列包含起始密码子。27.根据权利要求24至26中任一项所述的RTM，其进一步包含位于所述结合结构域下游(3')的核酶序列，其中所述核酶序列切割所述结合结构域的所述RTM 3'以除去下游核苷酸序列。28.一种核酸，其编码根据前述权利要求中任一项所述的RTM。29.一种核酸，其编码HSV胸苷激酶，所述HSV胸苷激酶包含作为SEQ ID NO:6的变体的氨基酸序列，所述氨基酸序列在对应于SEQ ID NO:6的位置46和60的位置处，任选地在对应于SEQ ID NO:6的位置1、46和60的位置处，具有相对于SEQ ID NO:6的修饰。30.根据权利要求29所述的核酸，其中所述HSV胸苷激酶包含作为SEQ ID NO:6的变体的氨基酸序列，所述氨基酸序列在对应于SEQ ID NO:6的位置46...

【专利技术属性】
技术研发人员：C，
申请(专利权)人：剑桥企业有限公司，
类型：发明
国别省市：