组合物和方法技术

本发明专利技术涉及已被修饰以插入氨基酸序列的腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白和/或使用本发明专利技术的AAV衣壳蛋白靶向小胶质细胞或脑巨噬细胞的方法。法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】组合物和方法


[0001]本专利技术涉及已被修饰以插入氨基酸序列的腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白和/或使用本专利技术的AAV衣壳蛋白靶向小胶质细胞或脑巨噬细胞的方法。

技术介绍

[0002]小胶质细胞是中枢神经系统(CNS)的组织驻留巨噬细胞，在CNS免疫防御、发育和体内平衡中发挥着关键作用(Schafer and Stevens 2015；Li and Barres 2018；Salter and Stevens2017；Wolf et al.,2017；Prinz et al.,2019)。这些高度动态的细胞不断对其环境做出反应(Gosselin et al.2017)。遗传学研究也强烈暗示神经变性、神经炎症以及神经精神和神经发育病症中的小胶质细胞功能障碍(Guerreiro et al.2013；Jonsson et al.2013；Tansey,Cameron,and Hill 2018；Gjoneska et al.2015；Young et al.,2019)。功能上来讲，小胶质细胞似乎随着年龄的增长而失去能力，尤其是在神经退行性和神经炎性病症的情况下。这方面的具体实例是在慢性脱髓鞘疾病，诸如多发性硬化(MS)的情况下，其中小胶质细胞占据损伤部位并吞噬碎片的能力的减少随着年龄的增长而降低(Kotter et al.,2006；Natrajan et al.,2015；Ruckh etal.,2012)。此外，人类研究进一步表明，小胶质细胞可能是MS中的损害性因素，其中活化的小胶质细胞的丰富是脱髓鞘和损伤形成前的早期事件，与临床残疾相关。
[0003]在神经变性的情况下，小胶质细胞中功能的特定变化与帕金森氏病和阿尔茨海默氏病相关，其中促炎性小胶质细胞已被证明与Aβ斑块相关。此外，小胶质细胞吞噬活性降低是肌萎缩侧索硬化的特征(Wolf et al.2017)。关于神经精神障碍，在孤独症谱系障碍患者中已经证实了不同脑区中小胶质细胞密度和形态的变化，同时在精神分裂症患者中观察到伴随神经炎症改变的小胶质细胞活化异常(Leza et al.2015)。
[0004]小胶质细胞是CNS中有吸引力的治疗靶点，这主要是因为它们数量丰富并且能够自我更新。目前，对非特异性治疗(诸如CSF1R的抑制剂)的干预有限，这些治疗已用于阿尔茨海默氏病的动物模型(Spangenberg et al.,2019)。然而，根据近来表明小胶质细胞在动物模型和人类中以不同的功能状态存在的证据(Young et al.,2019；Olah et al.2018；Keren
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Shaul et al.2017；Hammond et al.2019；Masuda et al.2019；Mrdjen et al.2018；Mathys et al.2017)，更有吸引力的提议是选择性地且精确地对细胞的相关亚群进行功能性基因编辑。
[0005]PHP.B质粒的创建允许通过体循环高效感染CNS(Deverman et al.,2016)。最近，PHP.eB已被用于对CNS中的干细胞进行基因编辑(Segel et al.,2019)。虽然已经证明PHP.eB在转导神经元方面是有效的，但还没有证明用PHP.eB实现小胶质细胞的体内感染是可能的(Deverman et al.,2016；Kumar et al.,2020)。
[0006]因此，需要用于体内靶向小胶质细胞的改进的组合物和方法。本专利技术通过提供还能够感染小胶质细胞和脑驻留巨噬细胞的新型AAV衣壳蛋白和AAV颗粒解决了这一需要，其包含源自于募集的单核细胞的CNS
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浸润性巨噬细胞。

技术实现思路

[0007]本专利技术基于能够被引入至AAV病毒颗粒的新型AAV衣壳蛋白的创建。具有经修饰的衣壳蛋白的AAV能够穿过血脑屏障，来有效地靶向整个CNS的细胞，包括小胶质细胞和脑巨噬细胞，其包含源自于募集的单核细胞的CNS
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浸润性巨噬细胞。
[0008]这些新型AAV衣壳蛋白已被修饰以在AAV衣壳结合臂中插入氨基酸序列。本专利技术的新型AAV衣壳蛋白可被整合至对靶向小胶质细胞特别有效的病毒颗粒中。因此，与先前描述的AAV相比，包含本专利技术的新型AAV衣壳蛋白的AAV是高度有利的，因为它们证实了在整个CNS的细胞中的有效转导。
[0009]因此，本专利技术提供了：
[0010]一种腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其中，所述AAV衣壳蛋白已被修饰以插入具有以下的氨基酸序列：
[0011](a)SEQ ID NO:1的氨基酸序列，或其具有单个氨基酸取代的变体；
[0012](b)SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或其具有单个氨基酸取代的变体；
[0013](c)SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或其具有单个氨基酸取代的变体；
[0014](d)SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或其具有单个氨基酸取代的变体；
[0015](e)SEQ ID NO:5的氨基酸序列，或其具有单个氨基酸取代的变体；
[0016](f)SEQ ID NO:6的氨基酸序列，或其具有单个氨基酸取代的变体；
[0017](g)SEQ ID NO:7的氨基酸序列，或其具有单个氨基酸取代的变体；
[0018](h)SEQ ID NO:8的氨基酸序列，或其具有单个氨基酸取代的变体；或者
[0019](i)SEQ ID NO:9的氨基酸序列。
[0020]本专利技术还提供了：
[0021]编码根据本专利技术的AAV衣壳蛋白的核酸；包含根据本专利技术的核酸的重组DNA；包含根据本专利技术的核酸或重组DNA的宿主细胞；包含根据本专利技术的AAV衣壳蛋白的病毒颗粒；生产本专利技术病毒颗粒的宿主细胞；包含根据本专利技术的病毒颗粒的非人转基因动物；或者，包含根据本专利技术的AAV衣壳蛋白、核酸或病毒颗粒，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
[0022]本专利技术还提供了：
[0023]使用根据本专利技术的AAV衣壳蛋白靶向小胶质细胞或脑巨噬细胞的方法；该方法包括：将重组AAV载体引入哺乳动物；所述重组AAV载体编码被包裹在根据本专利技术的衣壳蛋白中的感兴趣的基因、基因编辑构建体、抗体或抗原结合片段或者基因沉默构建体。
附图说明
[0024]图1：创建感染随机文库的载体设计图示。(A)含有随机文库插入的PHP.eB AAV的示意图。(B)用于创建新型病毒文库的转移载体。PHP.eB衣壳序列在氨基酸位置588处被分裂，PHP.eB结合臂被具有产生1.9448e9种不同病毒能力的21个碱基对的随机文库所取代。该质粒进一步编码GFP荧光标签，该标签与衣壳基因共表达以识别被感染的细胞。(C)AAV生产所需的rep和cap基因在另外的质粒中提供。用于文库搜索的cap基因包括3个沉默位点来阻止AAV9 VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的表达。
[0025]图2：用PHP.eB衣壳和GFP转基因(GFP)感染CNS组织本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其中，所述AAV衣壳蛋白已被修饰以插入具有以下的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:1的氨基酸序列，或其具有单个氨基酸取代的变体；(b)SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或其具有单个氨基酸取代的变体；(c)SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或其具有单个氨基酸取代的变体；(d)SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或其具有单个氨基酸取代的变体；(e)SEQ ID NO:5的氨基酸序列，或其具有单个氨基酸取代的变体；(f)SEQ ID NO:6的氨基酸序列，或其具有单个氨基酸取代的变体；(g)SEQ ID NO:7的氨基酸序列，或其具有单个氨基酸取代的变体；(h)SEQ ID NO:8的氨基酸序列，或其具有单个氨基酸取代的变体；或者(i)SEQ ID NO:9的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的AAV衣壳蛋白，其中，与没有氨基酸插入的AAV衣壳蛋白相比，所述氨基酸序列的插入引起小胶质细胞或脑巨噬细胞中转导效率的增加。3.根据权利要求1或2所述的AAV衣壳蛋白，其中，所述AAV衣壳蛋白已被修饰以插入具有以下的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:1的氨基酸序列；(b)SEQ ID NO:2的氨基酸序列；(c)SEQ ID NO:3的氨基酸序列；(d)SEQ ID NO:4的氨基酸序列；(e)SEQ ID NO:5的氨基酸序列；(f)SEQ ID NO:6的氨基酸序列；(g)SEQ ID NO:7的氨基酸序列；或者(h)SEQ ID NO:8的氨基酸序列。4.根据权利要求1至3中任一项所述的AAV衣壳蛋白，其中，未修饰的AAV衣壳蛋白是野生型AAV1、AAV2、AAV5、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh10、AAVretrograde或PHP.eB衣壳蛋白。5.根据权利要求1至4中任一项所述的AAV衣壳蛋白，其中，未修饰的AAV衣壳蛋白是野生型PHP.eB衣壳蛋白，或包含与SEQ ID NO:10具有至少80％序列一致性的序列的AAV衣壳蛋白。6.根据权利要求5所述的AAV衣壳蛋白，其中，所述氨基酸序列被插入在SEQ ID NO:10的氨基酸588和589之间，或者被插入在与SEQ ID NO:10具有至少80％序列一致性的序列中的等同位置处。7.根据权利要求1至6中任一项所述的AAV衣壳蛋白，其中：(a)所述AAV衣壳蛋白具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列；(b)所述AAV衣壳蛋白具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列；(c)所述AAV衣壳蛋白具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列；(d)所述AAV衣壳蛋白具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列；(e)所述AAV衣壳蛋白具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列；(f)所述AAV衣壳蛋白具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列；(g)所述AAV衣壳蛋白具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列；
(h)所述AAV衣壳蛋白具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列；或者(i)所述AAV衣壳蛋白具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列。8.编码权利要求1至7中任一项所述的AAV衣壳蛋白的核酸。9.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗宾，
申请(专利权)人：剑桥企业有限公司，
类型：发明
国别省市：