一种用于环介导等温扩增的引物探针组合及其应用制造技术

本发明专利技术中公开了一种用于环介导等温扩增的引物探针组合，所述引物为针对目标核酸序列设计的特异性等温扩增引物，所述引物包括一对外引物F3、B3，一对内引物FIP、BIP，一对环引物LF、LB；所述探针为非酶切线性荧光探针，所述探针片段长度为16

【技术实现步骤摘要】
一种用于环介导等温扩增的引物探针组合及其应用


[0001]本专利技术涉及分子生物学
，具体涉及一种用于环介导等温扩增的引物探针组合及其应用。

技术介绍

[0002]环介导等温扩增技术(1oop
‑
mediated isothermal amplification,LAMP)是Notomi于2000年专利技术的一种恒温核酸扩增方法，其特点是针对目标序列的6个区域设计4
‑
6条特异引物，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶在60
‑
65℃反应温度下，60分钟内即可实现109～10
10
倍的核酸扩增，具有操作简单、特异性强、检测效率高等特点，已在食品安全、微生物检验、临床诊断等方面得到了广泛应用。
[0003]LAMP是识别了目标序列上6
‑
8个独立的基因片段，而PCR是利用两条引物特异地识别目的片段的两个区域，因此从理论上讲，LAMP应该比PCR具有更高的特异性。但事实上，已经有多个研究证实，因为引物数目较多，LAMP更容易遇到由非特异扩增而带来的假阳性问题。
[0004]将荧光标记的探针用于LAMP是提高特异性的最佳选择之一。最先使用Taqman探针，此时需要具有5
’‑3’
外切活性的酶，而外切酶活性与链置换活性是矛盾的。目前商品化BST聚合酶均尽可能避免残留5
’‑3’
外切活性，各别商品化BST聚合酶(如NEB BST 3.0)明确表示不具有5
’‑3’
外切活性。如继续使用Taqman探针需要额外添加具有5
’‑3’
外切活性的Taq酶。其次，通过添加其他酶实现对探针的切割，如加入高保真酶或RNase H进行探针切割并收集荧光，此类方法探针设计比较复杂，需要做相应的特别设计。如使用高保真酶时需要探针3
’
端的错配，添加RNase H时探针需要序列中插入RNA残基。此外，还可以通过探针的特别结构实现荧光信号的变化，如分子信标探针、“蝎子”探针及双探针等，此类探针因为需要形成特别的二级结构(例如发夹、环、互补双链等)，需要添加额外的序列，对探针设计的要求较高。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于解决现有技术中存在的环介导等温扩增技术中荧光探针设计复杂，且需增加额外的序列或试剂才能进行检测的问题，提供一种用于环介导等温扩增的引物探针组合及其应用。
[0006]为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下：一种用于环介导等温扩增的引物探针组合，所述引物为针对目标核酸序列设计的特异性等温扩增引物，所述引物包括一对外引物F3、B3，一对内引物FIP、BIP，一对环引物LF、LB；所述探针为非酶切线性荧光探针，所述探针片段长度为16
‑
30bp，探针序列位于目标核酸序列上外引物F3及B3结合位置之间的区域；所述探针5
’
末端的碱基上标记淬灭基团，3'末端的碱基或探针序列中的胸腺嘧啶碱基标记荧光基团。
[0007]优选地，所述探针序列位于目标核酸序列上环引物LF及LB结合位置之间的区域。
[0008]优选地，所述探针3
’
端最近的非末端的胸腺嘧啶碱基标记荧光基团。
[0009]本专利技术还提供了上述引物探针组合在新型冠状病毒环介导等温扩增检测试剂盒制备中的应用。
[0010]基于上述应用，本专利技术提供了一种新型冠状病毒环介导等温扩增检测试剂盒，包括根据新型冠状病毒N基因设计的新型冠状病毒环介导等温扩增检测专用引物和探针：
[0011]外引物CovN
‑
F3：5
’‑
AGATCACATTGGCACCCG
‑3’
；
[0012]外引物CovN
‑
B3：5
’‑
CCATTGCCAGCCATTCTAGC
‑3’
；
[0013]内引物CovN
‑
FIP：5
’‑
TGCTCCCTTCTGCGTAGAAGCTTTTCAATGCTGCAATCGTGCTAC
‑3’
；
[0014]内引物CovN
‑
BIP：5
’‑
GGCGGCAGTCAAGCCTCTTCTTTTCCTACTGCTGCCTGGAGTT
‑3’
；
[0015]环引物CovN
‑
LF：5
’‑
TGGCAATGTTGTTCCTTGAGGAAGT
‑3’
；
[0016]环引物CovN
‑
LB：5
’‑
CCTCATCACGTAGTCGCAACAGTTC
‑3’
；
[0017]探针CovN
‑
LBp：5
’‑
BHQ1
‑
CCTCATCACGTAGTCGCAACAGTT(FAM)C
‑3’
，所述探针CovN
‑
LBp在序列5
’
端标记淬灭基团，3
’
端最近的非末端的胸腺嘧啶碱基标记荧光基团。
[0018]优选地，所述试剂盒还包括根据内参基因人类β
‑
ACTIN设计的引物和探针：
[0019]外引物AB
‑
F3：5
’‑
TGGTGGGCATGGGTCA
‑3’
；
[0020]外引物AB
‑
B3：5
’‑
TGGCCTTGGGGTTCAGG
‑3’
；
[0021]内引物AB
‑
FIP：5
’‑
GGTACTTCAGGGTGAGGATGCCttttGAAGGATTCCTATGTGGGCG
‑3’
；
[0022]内引物AB
‑
BIP：5
’‑
CCAACTGGGACGACATGGAGAAttttAGCACGGGGTGCTCCT
‑3’
；
[0023]环引物AB
‑
LF：5
’‑
TCTTGCTCTGGGCCTCGT
‑3’
；
[0024]环引物AB
‑
LB：5
’‑
CACCACACCTTCTACAATGAGC
‑3’
；
[0025]探针AB
‑
LFp：5
’‑
BHQ3
‑
TCTTGCTCTGGGCCT(CY5)CGT
‑3’
，所述探针AB
‑
LFp在序列5
’
端标记淬灭基团，3
’
端最近的非末端的胸腺嘧啶碱基标记荧光基团。
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于环介导等温扩增的引物探针组合，其特征在于，所述引物为针对目标核酸序列设计的特异性等温扩增引物，所述引物包括一对外引物F3、B3，一对内引物FIP、BIP，一对环引物LF、LB；所述探针为非酶切线性荧光探针，所述探针片段长度为16
‑
30bp，探针序列位于目标核酸序列上外引物F3及B3结合位置之间的区域；所述探针5
’
末端的碱基上标记淬灭基团，3'末端的碱基或探针序列中的胸腺嘧啶碱基标记荧光基团。2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述探针序列位于目标核酸序列上环引物LF及LB结合位置之间的区域。3.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述探针3
’
端最近的非末端的胸腺嘧啶碱基标记荧光基团。4.如权利要求1至3任一项所述的引物探针组合在新型冠状病毒环介导等温扩增检测试剂盒制备中的应用。5.一种新型冠状病毒环介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于，包括根据新型冠状病毒N基因设计的新型冠状病毒环介导等温扩增检测专用引物和探针：外引物CovN
‑
F3：5
’‑
AGATCACATTGGCACCCG
‑3’
；外引物CovN
‑
B3：5
’‑
CCATTGCCAGCCATTCTAGC
‑3’
；内引物CovN
‑
FIP：5
’‑
TGCTCCCTTCTGCGTAGAAGCTTTTCAATGCTGC AATCGTGCTAC
‑3’
；内引物CovN
‑
BIP：5
’‑
GGCGGCAGTCAAGCCTCTTCTTTTCCTACTGCTG CCTGGAGTT
‑3’
；环引物CovN
‑
LF：5
’‑
TGGCAATGTTGTTCCTTGAGGAAGT
‑3’
；环引物CovN
‑
LB：5
’‑
CCTCATCACGTAGTCGCAACAGTTC
‑3’
；探针CovN
‑
LBp：5
’‑
BHQ1
‑
CCTCATCACGTAGTCGCAACAGTT(FAM)C
‑3’
，所述探针CovN
‑
LBp在序列5
...

【专利技术属性】
技术研发人员：常建宇，邓先杰，褚维，纪钟书，邓树荣，于凯蓝，李霞，
申请(专利权)人：鹭盛驰濠北京科技发展有限责任公司，
类型：发明
国别省市：