人类胰腺腺泡细胞体外扩增并转分化为胰岛素产生细胞的方法技术

本发明专利技术涉及例如扩增哺乳动物腺泡细胞的方法，包括在包含细胞培养基和细胞附着表面的细胞培养体系中培养细胞，条件是其中所述的腺泡细胞经过３－４倍的扩增并转分化为显示腺泡细胞和肝细胞特征的修饰的细胞表型（ＩＰ细胞）。本发明专利技术还涉及体外将这些ＩＰ细胞转化至胰岛素产生细胞的方法，包括在新的、限定的培养基中培养所述细胞。本发明专利技术还公开了适于进行这些方法的培养基、具有ＩＰ细胞表型和／或由这些方法产生的分离的细胞，以及完成这些方法的试剂盒。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本申请要求2002年5月28日提交的临时申请60/384,000的利益，其公开内容在此全部引入以供参考。
技术介绍
1.专利
本专利技术涉及组合物和方法，借此例如人胰腺腺泡细胞在支持扩展和转分化为腺上皮细胞并随后转分化成胰岛素产生细胞地条件下培养。
技术介绍
从器官供体取得胰岛素产生细胞并植入胰岛素依赖的I型糖尿病患者的潜在益处是很清楚的。在Edmonton临床试验中，在移植了来自器官供体来源的完整的胰岛的许多患者已经不用外源胰岛素递送存活了大约两年。但是，现有技术需要两个器官供体胰腺来产生足够量的胰岛(大约一百万个胰岛，每个由大约1000个细胞组成)移植入一个糖尿病患者用于细胞疗法。因此，糖尿病领域中的重点是鉴定用于移植的胰岛素产生细胞的新来源。尝试了许多方法，包括收获胰岛后并于移植前进行扩增以及从来自骨髓的干细胞样细胞或从位于胰腺的前体细胞产生新的胰岛。这些方法面临的问题是维持长时间培养后胰岛的功能，以及维持来自骨髓和胰腺的可以控制用于胰岛素产生的比较稀少的干细胞样细胞的功能。据报导来自胰腺的导管(ductular)前体干细胞样细胞比骨髓来源的细胞在分化为成胰岛素产生细胞上更有效，这可能反映了其来源位点(即胰腺)，在那里它们必然接触到许多有关胰腺微环境的分化信号。胰腺中最丰富的细胞种类是腺泡细胞，其占胰腺的约85％。腺泡细胞作用是产生和分泌消化酶并从导管细胞区室在发育过程中产生如胰岛细胞。已经报导腺泡细胞在体外培养时，特别是在压力条件下，能进行“转分化”成类似导管细胞的细胞类型，如通过CK19、CK7和碳酸酐酶的表达所确定的(所有都被作者认为是导管细胞的标志)(Kerr-Conte，1996；WO02/29010 A2，Hall等人，1992)。另外，Bouwens等人(1998)已经表明在体内，在胰腺导管结扎模型中，在胰腺的结扎部分的腺泡细胞发生了转分化成具有导管表型的细胞。进一步的工作表明胰腺结扎部分的导管细胞的进一步的分化可以产生胰岛素产生细胞。也报导所述的腺泡细胞在初级培养中是有限存活的，某些培养条件导致一周内至少50％细胞的丧失。同时证明体外初级导管细胞在某些培养条件下转化成胰岛素产生细胞(例如Bonner Weir，2000，U.S.Pat.No.6,011,647)，没有报导说来自腺泡的细胞体外进一步分化产生胰岛样细胞。在开发本体系之前，初级胰腺腺泡细胞在含有血清的培养基(由于与使用血清有关的危险性和不确定性而不合需要)中或在复杂无血清培养基制剂中都没有被扩增分化成胰岛素产生细胞。类似的，已经转分化为胰岛素产生细胞的胰腺腺泡细胞没有扩增，产生少量的具有胰岛素产生表型的细胞。而且，以前从不可能使用腺泡细胞作为原料获得大量的胰岛素产生细胞。因此，需要简单的细胞培养体系和方法用于通过扩增和转分化丰富的胰腺腺泡细胞快速产生大量的能进一步分化为例如胰岛素产生细胞的细胞。而且，需要细胞培养体系和方法用于培养并转化该细胞为胰岛素产生细胞。此处公开的一种细胞培养体系和相关的方法可以简单地、一步法产生扩增的培养物，其含有至少80％的中间祖细胞，其能产生胰岛素产生细胞。另一种细胞培养体系和相关的方法可以进一步培养这些中间祖细胞和其它腺上皮细胞以获得胰岛素产生细胞。IP细胞和胰岛素产生细胞都将用于治疗如糖尿病等的疾病的基于细胞的疗法。专利技术简述本专利技术提供了组合物和方法，由此例如腺泡细胞可以被成功的体外培养，经过一段时间细胞数目发生3-4倍的增加，并在培养的早期(离体2-3天)产生共表达腺泡和导管性标志的细胞群，然后最终(例如约离体7-8天)获得特征在于表达一些腺泡相关基因以及一些肝相关基因的修饰的表型。在约离体7-8天的这些修饰的细胞表达的基因包括例如导管细胞角蛋白(CK7、CK8、CK18和CK19)、肝核因子1(HNF1)、α-1抗胰蛋白酶、π-谷胱甘肽S转移酶(π-GST)、肝特异性(碱性螺旋-环-螺旋)(bHLH)转录因子、Thy-1、CCAAT/增强子结合蛋白(C/EBP)-α和C/EBP-β。这些细胞如果有也很少表达胰腺相关基因碳酸酐酶、囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)、弹性蛋白酶和淀粉酶。“如果有也很少”表达基因此处的意思是基因表达在常规方法(如此处所述的杂交和免疫细胞化学方法)下通常是检测不到的，但是表达可能被特别灵敏的方法(如基于PCR的分析)检测到。这种类型的修饰的细胞此处是指中间祖细胞(IP)。扩增的/转分化的腺泡细胞(IP细胞)可以使用通常的含有血清的培养基制备，或在优选的方法中，可以无需血清在一种或多种可溶性活性因子存在下在一个表面上制备，所述的表面包含一种或多种细胞外基质分子(ECM)。ECM可以在可溶性活性因子存在下存在于二维或三维培养体系中。从该培养物产生的I P细胞可直接用于某些医学用途。例如，有证据表明该细胞当植入糖尿病患者中时可在某些条件下成为功能性胰岛素产生细胞。该细胞也可以用于药物开发和毒性研究。另外，根据本专利技术的一个方面，IP细胞可以在无血清培养基中进一步培养，所述的无血清培养基由任何标准的无血清基础培养基(例如DMEMHamsF12)和BSA以及因子的组合组成，包括ECM，小分子和生长因子。5-10天培养后，IP细胞进行另外的分化步骤，最后形成表达胰岛素原和C-肽的细胞聚合体。用高葡萄糖培养基攻击(challenge)该培养物导致胰岛素和C-肽释放到培养基中，这表明在这些培养物中产生了有功能的胰岛样细胞。因此，本专利技术一方面提供了细胞培养体系，其包含也刺激细胞扩增的较好的细胞附着表面，以及简单的细胞培养基，所述的培养基包括在基础培养基组合物中加入有效量的一种或多种可溶性的活性因子或血清(例如胎牛血清)。所述的细胞培养体系将对哺乳动物上皮细胞的初级培养特别有用，特别是人上皮细胞。在优选的实施方案中，所述的细胞培养体系用于扩增和转分化初级腺泡细胞，特别是人胰腺腺泡细胞。用于所述的细胞培养体系的细胞附着表面是细胞可以附着并扩增的任何表面，既包括二维(例如平板、烧瓶、滚瓶、培养皿、孔等)也包括三维(例如支架)环境。优选的表面包含至少一种ECM，或其肽片段。在某些情况中，细胞可能从这些表面脱落并形成自我支持的聚合体。合适的片段包括由与ECM的氨基酸序列的任何部分相同的三个或多个氨基酸残基的序列组成的肽。所述的片段可以通过本领域技术人员已知的方法容易的制备并检测。最优选地，所述的表面是胶原I的层。许多其它本领域已知的表面也适合，如胶原VI、胶原IV、玻连蛋白或纤连蛋白。由于容易和便宜胶原I是优选的。加入可溶性活性因子的基础培养基可能是适于上皮细胞生长和分化的任何细胞培养基。其包括但不限于DMEM、Hams12、MEM、M-199和RPMI。本领域技术人员已知这些培养基的基本要求和许多合适的实例。向这些基础培养基中加入血清(例如胎牛血清)或稳定蛋白质如牛血清白蛋白(BSA)以及有效量的可溶性活性因子。该培养基优选无血清的。用于初级胰腺腺泡细胞扩增并转分化为IP细胞的可溶性活性因子包括生长因子如HGF受体活化剂和EGF受体活化剂。优选的可溶性活性因子包括一种或多种EGF和转化生长因子-α、IGF1、HGF、β动物纤维素(betacellulin)、催乳素和胃泌素1。H本文档来自技高网...

【技术保护点】
扩增哺乳动物腺泡细胞的方法，包含在一定条件下在含有细胞培养基和细胞附着表面的细胞培养系统中培养所述细胞，在该条件下，所述腺泡细胞经过３－４倍扩增并转分化为显示腺泡细胞和肝细胞特征的改变的细胞表型（ＩＰ细胞）。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：SC普里斯耐尔，N罗宾斯，M赫达兰，P哈兰德，PP拉塔，DW沙普，M卡茨，C麦金太尔，
申请(专利权)人：贝克顿迪金森公司，诺沃塞尔公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]