【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
技术实现思路
【技术保护点】
1.一种用于检测样品中的靶核酸序列的方法，包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述裂解缓冲液和/或试剂组合物包含一种或更多种还原剂，并且任选地所述一种或更多种还原剂包括以下中的一种或更多种：2-巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、二硫赤藓糖醇(DTE)、还原型谷胱甘肽、半胱胺、三正丁基膦(TBP)、二硫赤藓糖醇、三(3-羟丙基)膦(THPP)、2-巯基乙胺-HCl、二硫代丁胺(DTBA)、半胱氨酸、半胱氨酸-巯基乙酸酯、亚硫酸盐、巯基乙酸和羟乙基二硫化物(HED)。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述裂解缓冲液包含硫酸镁、硫酸铵、EDTA和EGTA中的一种或更多种。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述裂解缓冲液的pH为约1.0至约10.0，任选地所述裂解缓冲液的pH为约2.2。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述样品核酸包括样品核糖核酸和/或样品脱氧核糖核酸，任选地所述样品核酸包括细胞RNA、mRNA、微RNA、细菌RNA、病毒RNA或其组合。
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种用于检测样品中的靶核酸序列的方法，包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述裂解缓冲液和/或试剂组合物包含一种或更多种还原剂，并且任选地所述一种或更多种还原剂包括以下中的一种或更多种：2-巯基乙醇、二硫苏糖醇(dtt)、三(2-羧乙基)膦(tcep)、二硫赤藓糖醇(dte)、还原型谷胱甘肽、半胱胺、三正丁基膦(tbp)、二硫赤藓糖醇、三(3-羟丙基)膦(thpp)、2-巯基乙胺-hcl、二硫代丁胺(dtba)、半胱氨酸、半胱氨酸-巯基乙酸酯、亚硫酸盐、巯基乙酸和羟乙基二硫化物(hed)。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述裂解缓冲液包含硫酸镁、硫酸铵、edta和egta中的一种或更多种。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述裂解缓冲液的ph为约1.0至约10.0，任选地所述裂解缓冲液的ph为约2.2。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述样品核酸包括样品核糖核酸和/或样品脱氧核糖核酸，任选地所述样品核酸包括细胞rna、mrna、微rna、细菌rna、病毒rna或其组合。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种扩增试剂包括逆转录酶和/或具有超嗜热生物聚合酶活性的酶，任选地所述具有超嗜热生物聚合酶活性的酶具有逆转录酶活性。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述试剂组合物包含逆转录酶、具有超嗜热生物聚合酶活性的酶、第一引物、第二引物和逆转录引物中的一种或更多种。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中：
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述试剂组合物被冻干、热干燥和/或包含一种或更多种添加剂，任选地所述一种或更多种添加剂包括：
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种保护剂与所述一种或更多种扩增试剂的摩尔比在约10:1至约1:10之间，任选地所述摩尔比为约2:1。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种保护剂包括式(i)的环糊精化合物：
12.根据权利要求11所述的方法，其中：
13.根据权利要求11-12中任一项所述的方法，其中所述环糊精化合物是2-羟丙基-α-环糊精、2-羟丙基-β-环糊精(2ηρβcd)、羟丙基-β-环糊精(ηρβcd)、甲基-β-环糊精(μβcd)、2-羟丙基-γ-环糊精、α-环糊精、β-环糊精或γ-环糊精、或其盐、酯、溶剂化物或水合物。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种裂解试剂包含：
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述样品核酸包含含有所述靶核酸序列的核酸，任选地所述靶核酸序列包含彼此互补的第一链和第二链。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中扩增所述靶核酸序列包括：
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述扩增不包括使用除具有超嗜热生物聚合酶活性的酶之外的任何酶，和/或所述扩增不包括使所述核酸热变性和/或酶促变性，任选地所述方法不包括在步骤(c)之前或期间使所述核酸与单链dna结合蛋白接触。
18.根据权利要求15-17中任一项所述的方法，其中所述核酸是双链dna。
19.根据权利要求15-18中任一项所述的方法，其中所述核酸是逆转录反应的产物，任选地所述核酸是从样品核糖核酸产生的逆转录反应的产物，还任选地步骤(c)包括通过逆转录反应产生所述核酸。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述样品核酸包括样品核糖核酸，并且其中所述方法包括使样品核糖核酸与逆转录酶和/或逆转录引物接触以产生cdna。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中扩增所述靶核酸序列包括：
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述方法不包括使用除逆转录酶和/或具有超嗜热生物聚合酶活性的酶之外的任何酶。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中步骤(d)还包括确定所述样品中包含所述靶核酸序列的dsdna和/或核酸的量。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述具有超嗜热生物聚合酶活性的酶具有与seq id no:1的氨基酸序列或其功能片段至少约90％相同的氨基酸序列，任选地所述具有超嗜热生物聚合酶活性的酶具有与seq id no:1的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列，还任选地所述具有超嗜热生物聚合酶活性的酶是包含seq id no:1的氨基酸序列的聚合酶，任选地所述具有超嗜热生物聚合酶活性的酶具有低外切核酸酶活性或没有外切核酸酶活性。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中扩增所述靶核酸序列在约55℃至约75℃的恒定温度进行，任选地扩增所述靶核酸序列在约65℃的恒定温度进行。
26.根据权利要求7-25中任一项所述的方法，其中：
27.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，还包括使所述核酸扩增产物与能够与所述扩增产物杂交的信号产生寡核苷酸接触，其中所述信号产生寡核苷酸包含荧光团、猝灭剂或二者。
28.根据权利要求1-27中任一项所述的方法，其中检测所述核酸扩增产物包括检测荧光信号，任选地所述荧光信号来自分子信标。
29.根据权利要求19-28中任一项所述的方法，其中所述样品核糖核酸同时与所述逆转录酶和所述具有超嗜热生物聚合酶活性的酶接触，任选地所述样品核糖核酸同时与逆所述转录酶、所述具有超嗜热生物聚合酶活性的酶以及所述第一引物和所述第二引物接触，还任选地所述样品核糖核酸同时与所述逆转录酶、所述具有超嗜热生物聚合酶活性的酶、所述第一引物、所述第二引物和所述逆转录引物接触。
30.根据权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种裂解性剂能够使所述一种或更多种扩增试剂变性，并且其中所述一种或更多种保护剂能够防止所述一种或更多种扩增试剂被所述一种或更多种裂解性剂变性。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种保护剂能够隔离所述一种或更多种裂解性剂，从而防止所述一种或更多种扩增试剂被所述一种或更多种裂解性剂变性。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的方法，其中大于约90％的所述一种或更多种裂解性剂被所述一种或更多种保护剂隔离。
33.根据权利要求1-32中任一项所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：张红华，安德鲁·P·米勒，布里翁·梅尔梅，蔡立君，
申请(专利权)人：贝克顿迪金森公司，
类型：发明
国别省市：
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