胰岛样细胞的培养液及培养方法技术

本发明专利技术涉及细胞培养领域，尤其涉及胰岛样细胞的培养液及培养方法。本发明专利技术提供的胰岛样细胞培养液，包括基础培养液、转铁蛋白、牛血清白蛋白、纤粘连蛋白、硒酸、孕酮、丙酮酸钠、胰岛素和PDX-1；在原代培养中，细胞生长良好，细胞贴壁迅速、能够很好的分离胰岛样细胞与其他胰腺细胞。在此基础上添加碱性成纤维生长因子和表皮生长因子用于传代培养，细胞增殖旺盛，且具有分化功能的胰岛干细胞数量较多。经传代6代，细胞仍呈对数增殖，且细胞数量扩增了613倍。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及细胞培养领域，尤其涉及。
技术介绍
糖尿病是一种体内糖代谢紊乱引起的健康问题。I型糖尿病患者通常依靠胰岛素 皮下注射等措施维持体内的糖代谢功能，但只治标而不治本。而目前中国糖尿病患者超过 4100万人，30岁以上人群糖尿病的发病率达到5%。而胰岛细胞移植则是一个比较理想的 根治糖尿病的方法。但是该方法每次移植需要2-4个供体胰腺，而受制于伦理学以及传统 观念，供体短缺严重，完全不足以满足I型糖尿病患者的需求。 理论上讲，胰岛β细胞可来源于多能干细胞（主要是胚胎干细胞）或它的直接前 体细胞（胰导管细胞），还可来源于其它组织特异性干细胞的横向分化。Ramiya等从未发病 的成年非肥胖糖尿病（NOD)小鼠的胰导管上皮结构中分离出胰腺干细胞，经过长期体外培 养，能诱导分化为Langerhans'胰岛，证明成年胰导管上皮细胞具有干细胞的特性。最近， Zulewski等发现，人和大鼠胰岛中均存在Nestin染色阳性的细胞，这些细胞具有干细胞的 特性，在体外培养中能分化成胰腺外分泌细胞、导管细胞和内分泌细胞以及肝细胞。因此， 除了胰腺导管外，胰岛中也存在多潜能的胰岛前体细胞。 因此如果能在体外大规模培养胰岛干细胞，则能提供大量的胰岛细胞，从而为胰 岛移植提供足够的种子细胞。并且由于胰岛干细胞的免疫原性较低，在移植到患者体内可 以减少排斥反应，增加移植成功率，也可以减少免疫抑制剂的使用，从而减少对身体以及胰 岛细胞的毒害作用，增加远期疗效。 然而现有技术对胰岛细胞的培养效果并不理想，体外培养的胰岛细胞通常增殖能 力较差，且其中具有分化功能的胰岛干细胞数量少，不同批次培养的干细胞的稳定性也很 难保证。并且现有技术中，胰岛细胞传代非常困难，通常P4代后，细胞便不再增殖且干细胞 特性消失。并且，现有技术为了维持细胞的活性和稳定性，通常在培养基中添加了异源血 清，大大增加了移植过程中人体排异反应的风险。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供。 以本专利技术提供的培养液培养胰岛细胞，细胞增殖能力前，具有分化功能的胰岛干细胞数量 较多，且未添加异种血清。 本专利技术提供的胰岛样细胞培养液，包括基础培养液、转铁蛋白、牛血清白蛋白、纤 粘连蛋白、硒酸、孕酮、丙酮酸钠、胰岛素和rox-i。 PDX-I即胰-十二指肠同源框-1，现已知rox-ι在胰腺的生长发育过程中不仅是 β细胞中胰岛素基因的转录因子，而且对于β细胞的分化表达及延缓β细胞的自身凋亡 方面也起到关键作用。 孕酮又称黄体酮，为孕激素。在细胞培养中作为促进细胞生长的附加成分添加在 培养基中。 胰岛素能够促进细胞生长，提高细胞对葡萄糖的利用率。 牛血清白蛋白在动物细胞无血清培养中，添加白蛋白可起到生理和机械保护作用 和载体作用。 转铁蛋白又名运铁蛋白（transferrin，TRF，siderophilin)是血衆中主要的含铁 蛋白质，能结合铁离子，减少铁离子对细胞的毒性，促进细胞的生长。 纤粘连蛋白（fibronectin，FN)，广泛存在于动物组织和组织液中，是一种大分子 糖蛋白，具有多种生物活性，添加在培养基中能够促进细胞的贴壁。 硒酸，分子式为H2SeO4，提供给细胞硒元素，硒是谷胱甘肽过氧化物酶的必需成分， 并与能量代谢、糖脂代谢关系密切。 丙酮酸钠的分子式为CH3COCOONa,丙酮酸为细胞代谢必须物质，是糖代谢的底物， 用于提供碳源。 本专利技术将上述物质添加在基础培养液中用以胰岛样细胞的原代培养，结果显示， 在原代培养中，细胞生长良好，细胞贴壁迅速、能够很好的分离胰岛样细胞与其他胰腺细 胞。 在本专利技术的实施例中，其中各组分的含量为：转铁蛋白2mmol/L~4mmol/L、牛血 清白蛋白40 μ g/mL~60 μ g/mL、纤粘连蛋白4 μ g/mL~6 μ g/mL、硒酸2mmo1 /T,~3mmol/ L、孕酬 3mmol/L ~5mmol/L、丙酬酸纳 40ng/mT,~60ng/mL、膜岛素 15ng/mL ~25ng/mL、 PDX_115ng/mL ~35ng/mL〇 在一些实施例中，其中各组分的含量为：转铁蛋白3mmol/L、牛血清白蛋白50 μ g/ mL、纤粘连蛋白5 μ g/mL、硒酸2. 5mmol/L、孕酮4mmol/L、丙酮酸钠50ng/mL、胰岛素20ng/ mL、PDX-115ng/mL 〇 在本专利技术的实施例中，本专利技术提供的培养液中还包括碱性成纤维生长因子和表皮 生长因子。 碱性成纤维生长因子（bFGF)在体内具有潜在的促血管生成活性。 表皮细胞生长因子（EGF)在体内能够促进皮肤及角膜中表皮细胞的生长。 本专利技术将bFGF和EGF添加在培养液中，用于胰岛样细胞的传代培养，实现显示，在 传代培养过程中，细胞增殖旺盛，且具有分化功能的胰岛干细胞数量较多。经传代6代，细 胞仍呈对数增殖，且细胞数量扩增了 613倍。 在本专利技术的实施例中，其中碱性成纤维生长因子的含量为15ng/mL~25ng/mL ;表 皮生长因子的含量为15ng/mL~25ng/mL。 在一些实施例中，其中碱性成纤维生长因子的含量为20ng/mL ;表皮生长因子的 含量为20ng/mL。 在本专利技术的实施例中，基础培养液为DMEM/F12培养液。 DMEM/F12培养液为一种无血清培养基，本专利技术提供的培养液中也不包含异源血 清，从而降低了细胞移植后人体发生排异反应的风险。 本专利技术还提供了一种胰岛样细胞的培养方法，包括以下步骤： 步骤1 :以培养液1重悬胰腺细胞至密度为I X IO5个/mL~I X 10 6个/mL，培养 Ih后，转移未贴壁细胞； 步骤2 :将所述未贴壁细胞以培养液1培养24h后，弃除未贴壁细胞及培养液1，获 得贴壁细胞； 步骤3 :将所述贴壁细胞以培养液1培养至细胞融合度为70%~90%后，以培养 液2传代培养； 培养液1包括：基础培养液、转铁蛋白、牛血清白蛋白、纤粘连蛋白、砸酸、孕酬、丙 酮酸钠、胰岛素和rox-i; 培养液2包括：基础培养液、转铁蛋白、牛血清白蛋白、纤粘连蛋白、硒酸、孕酮、丙 酮酸钠、胰岛素、PDX-1、碱性成纤维生长因子和表皮生长因子。 在本专利技术的实施例中，培养液1中各组分的含量为：转铁蛋白2mmol/L~4mmol/ L、牛血清白蛋白40 μ g/mL~60 μ g/mL、纤粘连蛋白4 μ g/mL~6 μ g/mL、硒酸2mmol/L~ 3mmol/L、孕酬 3mmol/L ~5mmol/L、丙酬酸纳 40ng/mT,~60ng/mL、膜岛素 15ng/mL ~25ng/ mL、PDX_115ng/mL ~35ng/mL〇 在一些实施例中，培养液I中各组分的含量为：转铁蛋白3mmol/L、牛血清白蛋白 50 μ g/mL、纤粘连蛋白5 μ g/mL、硒酸2. 5mmol/L、孕酮4mmol/L、丙酮酸钠50ng/mL、胰岛素 20ng/mL、PDX-115ng/mL〇 在本专利技术的实施例中，培养液2中各组分的含量为：转铁蛋白2mmol/L~4mmol/ L、牛血清白蛋白40 μ g/mL~60 μ g/mL、纤粘连蛋白4 μ g/mL~6 μ g/mL、硒酸2mmol/L~ 3mmol/本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种胰岛样细胞培养液，其特征在于，包括基础培养液、转铁蛋白、牛血清白蛋白、纤粘连蛋白、硒酸、孕酮、丙酮酸钠、胰岛素和PDX‑1。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈海佳，王一飞，葛啸虎，万桦，王小燕，李平，何炜均，
申请(专利权)人：广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44