一种海洋芽孢杆菌N6‑2及其产生的抗肿瘤活性蛋白，属于海洋微生物医药技术领域，该菌株能够产生具有抗肿瘤作用的活性蛋白，该海洋芽孢杆菌N6‑2于2014年11月23日保藏于中国武汉典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M2014586。该菌株能够稳定的表达抗肿瘤作用的新型活性蛋白，对人非小细胞肺癌细胞A549、人大细胞肺癌细胞NCI‑H460、人肝癌细胞BEL‑7402、人肝癌细胞HepG2、人胰腺癌细胞panc‑28、人子宫颈癌细胞Hela、人胶质瘤细胞U251、和人肾透明细胞腺癌细胞786‑0有细胞毒性，具有较好的研究和应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于海洋微生物医药
，具体涉及一种海洋芽孢杆菌N6-2及其产生的抗肿瘤活性蛋白。
技术介绍
由于南极地区独特的环境，使极地海洋微生物具备了独特的生理生化特性以适应其自身的生存需求，极地微生物体内的次级代谢产物已经成为新天然药物的重要来源地。目前对微生物的研究已经不仅仅局限于其基础研究，抗冻、抗辐射、抗肿瘤等菌株也被不断发现，且其产生的活性物质将极可能成为新的药用活性物质，有良好的研究及开发前景。美国专利检索产生抗肿瘤活性物质的海洋微生物已授权相关专利5项，2004年Fenical等发现了一种新型的海洋放线菌CNQ140，从中获得了环多烯类的天然产物，具有显著的抗肿瘤活性(Patent No.US7521414B2)。国内检索产生抗肿瘤活性物质的海洋微生物已授权相关专利2项，2007年东南大学的杨瑞丽等发现了一种产生抗肿瘤活性物质的海洋链霉菌,该菌的发酵液对多种肿瘤细胞均具有显著的细胞毒作用，并且能诱导肿瘤细胞凋亡，是一株具有预防和治疗肿瘤潜力的菌株资源(授权公告号：100554404))；2003年中国科学院海洋所的秦松等将海洋链霉菌Streptomyces sp.经发酵积累粗提物，利用硅胶层析等多种层析方法分离得到两种化合物，命名为chinikomycin A和B，其对多种人体肿瘤细胞有抑制作用(授权公告号：1296347)。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种海洋芽孢杆菌N6-2及其产生的抗肿瘤活性蛋白。一种海洋芽孢杆菌N6-2(Bacillus sp.N6-2)，该菌分离自南极海水，但不局限于该来源地，该菌株能够产生具有抗肿瘤作用的活性蛋白，该海洋芽孢杆菌N6-2于2014年11月23日保藏于中国武汉典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M2014586。进一步，所述的海洋芽孢杆菌N6-2菌株为革兰氏阴性菌，且具有芽孢，菌体形态呈现短杆棒状，多是有两个菌体相连，单个菌体的大小为：宽：0.9-1.5μm，长：1-3.7μm。进一步，所述的海洋芽孢杆菌N6-2的16S rDNA序列见序列表SEQ ID NO.1。本专利技术还提供一种海洋芽孢杆菌N6-2活性蛋白，该活性蛋白的分子量为24kDa，所述活性蛋白的cDNA编码序列见序列表SEQ ID NO.2，氨基酸序见序列表SEQ ID NO.3。进一步，所述海洋芽孢杆菌N6-2活性蛋白的制备方法：海洋芽孢杆菌N6-2菌株，接种于含有种子培养基的试管中，在16-37℃的摇床中100-300rpm，培养25-30h；将上述培养后的菌株按3-7％(v/v)的接种量接种于盛有发酵培养基的摇瓶中，16-37℃，100-300rpm，发酵培养48-90h；取菌株发酵液，离心，除掉发酵液中的菌体和杂质，并调节其pH在6.5-7.5，即为粗制发酵样品；超滤法粗提活性物质，获得10～30kDa组分，用硫酸铵沉淀法浓缩活性组分，浓缩的海洋芽孢杆菌N6-2活性组分，过Q离子交换层析柱，将活性最好的穿透峰Q1脱盐后真空冷冻干燥保存，将收集的穿透峰Q1，过CM离子交换柱，收集活性最好的穿透峰C1，脱盐后真空冷冻干燥保存，即为海洋芽孢杆菌N6-2活性蛋白。进一步，所述的种子培养基的成分及终浓度：牛肉膏0.2-0.8％，蛋白胨1-2％，氯化钠0.3-1％，pH6.8-7.5。进一步，所述的发酵培养基的成分及终浓度：蔗糖0.5-1％，牛肉膏0.2-0.8％，蛋白胨1-2％，氯化钠0.3-1％，矿物油0.5-1‰，pH6.8-7.5。本专利技术还提供一种海洋芽孢杆菌N6-2活性蛋白的制备方法，其步骤为：(1)菌株的发酵：取海洋芽孢杆菌N6-2菌株，接种于含有种子培养基的试管中，在16-37℃的摇床中100-300rpm，培养25-30h；将上述培养后的菌株按4％(v/v)的接种量接种于盛有发酵培养基的摇瓶中，16-37℃，100-300rpm，发酵培养48-90h；取菌株发酵液，离心，除掉发酵液中的菌体和杂质，并调节其pH在6.5-7.5，即为粗制发酵样品。(2)超滤法粗提活性物质取海洋芽孢杆菌N6-2发酵液，在8000rpm下离心，除掉菌体与部分杂质。依次用分子量为50kDa、30kDa、10kDa、5kDa、3kDa的滤膜，截留发酵液，获得10～30kDa的组分，调节pH值至7.0；进一步，所述的种子培养基的成分及终浓度：牛肉膏0.2-0.8％，蛋白胨1-2％，氯化钠0.3-1％，pH6.8-7.5。进一步，所述的发酵培养基的成分及终浓度：蔗糖0.5-1％，牛肉膏0.2-0.8％，蛋白胨1-2％，氯化钠0.3-1％，矿物油0.5-1‰，pH6.8-7.5。(3)硫酸铵沉淀法浓缩活性组分取步骤(2)所述的10～30kDa组分，置于冰浴之中，缓慢向其中加入硫酸铵固体粉末，使其水溶液浓度达到30％，4℃静置2h，10000rpm离心，沉淀作为杂蛋白，遗弃；取上清液，向其中缓慢加入硫酸铵固体粉末，使其水溶液浓度达到65％，4℃静置2h，10000rpm，离心，弃上清，取沉淀；沉淀用50mmol/L的pH7.96三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液溶解，装入3kDa透析袋，置于相同缓冲液中透析，4h、8h、12h换一次缓冲液，既浓缩得海洋芽孢杆菌N6-2的活性组分。(4)Q离子交换层析取步骤(3)所述的浓缩的海洋芽孢杆菌N6-2活性组分，过Q离子交换层析柱，上样缓冲液为20-60mmol/L的pH6.0-8.0三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液，每次上样量为5-20mL，洗脱液为含1mol/L NaCl的上样Tris-HCl缓冲液，洗脱液以100％(v/v)的浓度进行洗脱，流速为3mL/min，检测波长为280nm，收集活性最好的穿透峰Q1，脱盐后真空冷冻干燥保存；进一步，上述步骤(4)中的上样缓冲液优选为50mmol/L，pH7.96。进一步，上述步骤(4)中每次上样量优选为5mL。(5)CM离子交换层析取步骤(4)中收集的穿透峰Q1，过CM离子交换柱，上样缓冲液为20-60mmol/L的pH6.0-9.0氢氧化钠甘氨酸缓冲液(NaOH-Glycine)，每次上样量为1-10mL洗脱液为含1mol/L NaCl的氢氧化钠甘氨酸上样缓冲液，洗脱液以100％(v/v)的浓度进行洗脱，流速为3mL/min，收集活性最好的穿透峰C1，脱盐后真空冷冻干燥保存，即为海洋芽孢杆菌N6-2活性蛋白。进一步，上述步骤(5)中的上样缓冲液优选为25mmol/L，pH9.0；进一步，上述步骤(5)中每次上样量优选为2mL。本专利技术还提供一种上述海洋芽孢杆菌N6-2活性蛋白在预防或治疗抗人肝癌、人子宫颈癌、人胶质瘤、人肺癌、人胰腺癌和人肾透明细胞腺癌药物和/或保健品中的应用。本专利技术与现有技术相比的有益效果：该菌株能够稳定的表达抗肿瘤作用的新型活性蛋白，对人非小细胞肺癌细胞A549、人大细胞肺癌细胞NCI-H460人肝癌细胞BEL-7402、人肝癌细胞HepG2、人胰腺癌细胞panc-28、人子宫颈癌细胞Hela、人胶质瘤细胞U251、和人肾透明细胞腺癌细胞786-0的体外增殖具有抑制作用。附图说明图1.海洋芽孢杆菌N6-2的系本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种海洋芽孢杆菌N6‑2，其特征在于该菌株能够产生具有抗肿瘤作用的活性蛋白，该海洋芽孢杆菌N6‑2于2014年11月23日保藏于中国武汉典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M2014586。
【技术特征摘要】
2016.04.28 CN 2016102796683;2016.06.07 CN 201610401.一种海洋芽孢杆菌N6-2，其特征在于该菌株能够产生具有抗肿瘤作用的活性蛋白，该海洋芽孢杆菌N6-2于2014年11月23日保藏于中国武汉典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M2014586。2.根据权利要求1所述的一种海洋芽孢杆菌N6-2，其特征在于所述的海洋芽孢杆菌N6-2菌株为革兰氏阴性菌，且具有芽孢，菌体形态呈现短杆棒状，多是有两个菌体相连，单个菌体的大小为：宽：0.9-1.5μm，长：1-3.7μm。3.根据权利要求1所述的一种海洋芽孢杆菌N6-2，其特征在于所述的海洋芽孢杆菌N6-2的16S rDNA序列见序列表SEQ ID NO.1。4.权利要求1所述的海洋芽孢杆菌N6-2产生的活性蛋白，该活性蛋白的分子量为24kDa，所述活性蛋白的cDNA编码序列见序列表SEQ ID NO.2，氨基酸序见序列表SEQ ID NO.3。5.根据权利要求4所述活性蛋白的制备方法：将海洋芽孢杆菌N6-2菌株接种于含有种子培养基的试管中，在16-37℃的摇床中100-300rpm，培养25-30h；将上述培养后的菌株按3-7％...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑兰红，康道乐，杨康利，朱美虹，梁方方，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37
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